Rho GTP酶激活蛋白9基因在急性髓細(xì)胞白血病中的作用機(jī)制

呂國慶，魏秀麗，吳隼

(1.a.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 血液科；b.生命科學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453100；2.新鄉(xiāng)市白血病分子診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院/新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 血液科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血系統(tǒng)的一種常見惡性腫瘤，其特征是未成熟的異常原始細(xì)胞不受控制地惡性增殖和正常血細(xì)胞的生長抑制。目前造血干細(xì)胞移植和化療是AML的常規(guī)治療方法，雖然造血干細(xì)胞移植是根治AML的方法，但是由于平均年齡(多數(shù)患者年齡在60歲以上)、移植配型、經(jīng)濟(jì)狀況和個(gè)人意愿等原因，多數(shù)患者失去造血干細(xì)胞移植機(jī)會(huì)，因此AML患者整體預(yù)后仍較差[1-3]。目前AML的分子機(jī)制仍不清楚，所以研究AML的分子機(jī)制，開發(fā)新型、高效、低毒的靶向治療藥物對(duì)提高AML的治療效果具有重要的臨床意義。Rho GTP酶激活蛋白9(Rho GTPase activating protein 9，ARHGAP9)是Rho GTP酶激活蛋白(Rho GTPase activating protein，Rho GAP)家族的成員，Rho GAP促進(jìn)與GTP結(jié)合的Rho GTPases的水解，從而使Rho GTPases轉(zhuǎn)化為非活性的GDP結(jié)合狀態(tài)，并抑制多種細(xì)胞過程，例如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4-8]。本研究旨在探討ARHGAP9基因在AML患者中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，用基因集富集分析方法探討其在AML中的分子機(jī)制，探討其生物學(xué)功能和分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本選擇2016年1月至2018年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院初診的52例AML患者作為研究對(duì)象。AML的診斷根據(jù)AML的相關(guān)指南和診療規(guī)范進(jìn)行[9-12]。留取患者的骨髓液或者外周血樣本。選擇48例健康者骨髓液或者外周血樣本作為對(duì)照組。用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)分離AML患者及健康者骨髓液或外周血細(xì)胞，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞培養(yǎng)方法：兩種細(xì)胞均是懸浮細(xì)胞，使用內(nèi)含青鏈霉素混合液、10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、濕度飽和、含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

1.3 癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)分析對(duì)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中的AML和其他腫瘤的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)ARHGAP9基因的表達(dá)進(jìn)行分析, 同時(shí)下載臨床資料數(shù)據(jù), 進(jìn)行臨床參數(shù)及預(yù)后分析。

1.4 RNA提取和轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒、qPCR試劑盒購自Promega公司。使用Trizol(Invitrogen公司)提取總RNA。加入TRIzo、氯仿，4 ℃下，11 000×g離心15 min。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入異丙醇，沉淀水相中的總RNA，4 ℃下，11 000×g離心10 min，棄上清。用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液洗滌RNA沉淀。加入25 μL無RNase水，充分溶解RNA沉淀。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、ABI 7300系統(tǒng)(ABI公司)對(duì)ARHGAP9基因進(jìn)行PCR定量檢測(cè)。qPCR引物：上游引物為5’-TGAGAATTCTGGCTACATGCAGCCG-3’；下游引物為5’-CCACTCGAGATGACCGGAAATATGTTTCTC-3’；看家基因GAPDH上游引物為5’-CTCCCATCTGGCAGGTAAC-3’；下游引物5’-CCACCTGTTGCTGTAG-3’。PCR 反應(yīng)條件如下。第一步，預(yù)變性：95 ℃，15 min。第二步，PCR反應(yīng)：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。第三步，溶解曲線分析。ARHGAP9mRNA定量用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算(△Ct為目的基因Ct值與看家基因Ct值之差；△△Ct值為實(shí)驗(yàn)樣品△Ct與對(duì)照樣品△Ct之差)。所有數(shù)據(jù)設(shè)置5個(gè)平行重復(fù)。

1.5 小干擾RNA轉(zhuǎn)染將AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞接種到6孔板上，密度為每孔3×105個(gè)細(xì)胞。ARHGAP9小干擾RNA(siRNA)5’-GGAACAATGATGTCCTGCAACCTCA-3’或?qū)φ誷iRNA(NC)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)收集和處理。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)ARHGAP9siRNA或?qū)φ誷iRNA(NC)轉(zhuǎn)染AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞48 h后，按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在第0、24、48、72 h用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.7 基因集富集分析采用基因集富集分析4.0.3軟件對(duì)TCGA中AML的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析。參照基因集來源于分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(molecular signatures database, MsigDB)[13]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用R 3.5.0、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)。 骨髓液或外周血細(xì)胞中ARHGAP9的mRNA水平比較采用t檢驗(yàn)，采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。采用描述性統(tǒng)計(jì)方法對(duì)患者的臨床資料進(jìn)行分析，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ARHGAP9基因在AML中的表達(dá)水平通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AML患者體內(nèi)ARHGAP9基因的表達(dá)水平高于健康者(P<0.05)。采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離AML患者和健康者的骨髓液或外周血細(xì)胞，提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)AML細(xì)胞中ARHGAP9基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AML樣本中ARHGAP9基因的表達(dá)水平高于健康者(P<0.05)。見圖1。

ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細(xì)胞白血病。

2.2ARHGAP9基因與AML患者臨床預(yù)后的關(guān)系對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的RNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在AML中ARHGAP9基因的高表達(dá)與患者的低生存率相關(guān)。見圖2。

2.3ARHGAP9基因表達(dá)與AML患者臨床各參數(shù)及分子特征的關(guān)系按照ARHGAP9基因表達(dá)中位數(shù)將TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分為高、低表達(dá)兩組，分析ARHGAP9基因表達(dá)高低與AML患者臨床各參數(shù)及分子特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因表達(dá)高低與年齡、性別、白細(xì)胞數(shù)量、骨髓中原始細(xì)胞比率、外周血原始細(xì)胞比率無關(guān)；ARHGAP9基因的低表達(dá)與FAB-M3、FAB-M5亞型相關(guān)(P<0.001，P=0.029)；ARHGAP9基因的高表達(dá)與FAB-M1亞型相關(guān)(P=0.047)。在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，ARHGAP9基因的高表達(dá)與正常核型及復(fù)雜核型相關(guān)(P=0.045，P=0.038)，ARHGAP9基因的低表達(dá)與FAB-M3中常見的染色體異常t(15；17)相關(guān)(P<0.001)。ARHGAP9基因表達(dá)與其他FAB亞型無相關(guān)性，與inv(16)/CBFβ-MYH11、t(8；21)/RUNX1-RUNX1T1無相關(guān)性。此外，ARHGAP9基因的低表達(dá)與AML的良好預(yù)后相關(guān)，而ARHGAP9基因的高表達(dá)與AML的中等預(yù)后相關(guān)。在AML的突變基因中，ARHGAP9基因的表達(dá)與常見的突變類型如FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TP53I無相關(guān)性。見表1。

表1 ARHGAP9基因表達(dá)與AML臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4ARHGAP9基因表達(dá)與其他腫瘤生存預(yù)后的關(guān)系對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除AML之外，在其他多種腫瘤如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)瘤、腎嫌色細(xì)胞癌和葡萄膜黑色素瘤中ARHGAP9基因的高表達(dá)與患者的低生存率相關(guān)。見圖3。

2.5ARHGAP9基因?qū)ML細(xì)胞增殖的影響將處于對(duì)數(shù)生長期的AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞用ARHGAP9siRNA或?qū)φ誷iRNA(NC)轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)ARHGAP9siRNA的干擾效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞中，干擾效果分別約75%和60%，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。在ARHGAP9siRNA作用0、24、48、72 h后，AMLSKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞系細(xì)胞的增殖減弱，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明ARHGAP9siRNA處理后，AMLSKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞系細(xì)胞的增殖受到抑制。見圖4。

2.6ARHGAP9基因在AML中的生物學(xué)功能對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與細(xì)胞黏附、白細(xì)胞增殖、移動(dòng)、分化等生物學(xué)功能呈正相關(guān)。見表2和圖5。

ARHGAP9為RhoGTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細(xì)胞白血病。

A為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；B為腦膠質(zhì)瘤；C為腎嫌色細(xì)胞癌；D為葡萄膜黑色素瘤；ARHGAP9為Rho GTP酶活性蛋白9。

A為ARHGAP9 siRNA在Kassumi-1細(xì)胞中的敲降效果；B為ARHGAP9 siRNA對(duì)Kassumi-1細(xì)胞增殖的影響；C為ARHGAP9 siRNA在SKNO-1細(xì)胞中的敲降效果；D為ARHGAP9 siRNA對(duì)SKNO-1細(xì)胞增殖的影響。

表2 ARHGAP9基因與AML的生物學(xué)功能

2.7ARHGAP9基因與AML相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系用基因集富集分析對(duì)TCGA中的AML數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究ARHGAP9相關(guān)的KEGG信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9與MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT信號(hào)通路呈正相關(guān)。見表3和圖6。

表3 ARHGAP9基因與AML相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系

A中ES=0.45，NES=2.46，P<0.001；B中ES=0.47，NES=2.39，P<0.001；C中ES=0.47，NES=2.28，P<0.001；D中ES=0.38，NES=2.14，P<0.001；ES為富集分?jǐn)?shù)；NES為歸一化富集分?jǐn)?shù)；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細(xì)胞白血病。

2.8ARHGAP9基因的相互作用蛋白用蛋白質(zhì)相互作用在線分析軟件STRING(https://string-db.org/)對(duì)ARHGAP9基因進(jìn)行相互作用蛋白分析，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與眾多Rho GTPase酶家族成員可發(fā)生相互作用，如：RAC1、RAC2、RAC3、CDC42、RHOA、RHOB、RHOC、RHOG、RHOH、RHOU等。提示ARHGAP9基因可以作用于眾多小G蛋白，從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。見圖7。

A中ES=0.32，NES=1.72，P<0.001；B中ES=0.39，NES=1.68，P=0.003；C中ES=0.42，NES=1.68，P<0.001；D中ES=0.33，NES=1.65，P<0.001；ES為富集分?jǐn)?shù)；NES為歸一化富集分?jǐn)?shù)；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML急性髓細(xì)胞白血病。

RAC2為RAC家族小G蛋白酶2；RAC1為RAC家族小G蛋白酶1；RHOA為Ras同源基因家族成員A；CDC42為細(xì)胞分裂控制蛋白42；RAC3為RAC家族小G蛋白酶3；RHOB為Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白R(shí)HOB；RHOC為Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白R(shí)HOC；RHOU為Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白R(shí)HOU；RHOG為Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白R(shí)HOG；RHOH為Rho相關(guān)GTP結(jié)合蛋白R(shí)HOH；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9。

3 討論

AML是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，異質(zhì)性強(qiáng)，總體預(yù)后不良，其分子機(jī)制不完全清楚，篩查與AML發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的相關(guān)基因和標(biāo)志物具有重要價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)AML患者ARHGAP9基因表達(dá)水平較健康者升高，而且其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。在其他多種腫瘤如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)瘤、腎嫌色細(xì)胞癌和葡萄膜黑色素瘤中ARHGAP9基因的高表達(dá)與患者的低生存率相關(guān)。在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院AML臨床樣本中也發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因表達(dá)水平高于健康者。有研究表明在乳腺癌、胃癌患者中ARHGAP9基因表達(dá)水平升高，而且與不良預(yù)后相關(guān)[6-7]。這些研究結(jié)果提示，ARHGAP9基因是癌癥的不良預(yù)后基因，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

體外實(shí)驗(yàn)將ARHGAP9siRNA轉(zhuǎn)染AML細(xì)胞系SKNO-1、Kassumi-1細(xì)胞后，細(xì)胞中ARHGAP9基因表達(dá)水平下降，細(xì)胞增殖受抑制。有研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因 mRNA在乳腺癌中高表達(dá)，而且ARHGAP9基因 mRNA的高表達(dá)與患者低存活率、臨床分期、腫瘤大小和腫瘤分化有關(guān)。敲低人乳腺癌細(xì)胞中的ARHGAP9基因可抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[6]。敲降胃癌細(xì)胞系SGC7901中的ARHGAP9可抑制胃癌細(xì)胞增殖、行動(dòng)、侵襲能力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，ARHGAP9敲降可通過Akt、p38信號(hào)通路抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9發(fā)揮作用[7]。ARHGAP9基因表達(dá)與年齡、性別、白細(xì)胞數(shù)量、骨髓中原始細(xì)胞比率、外周血原始細(xì)胞比率無關(guān)，但是外周血細(xì)胞數(shù)量與AML生存的關(guān)系呈現(xiàn)雙相性，低白細(xì)胞及高白細(xì)胞時(shí)預(yù)后均不良，中等數(shù)量白細(xì)胞時(shí)患者預(yù)后較好，ARHGAP9基因表達(dá)與不同數(shù)量白細(xì)胞分層的研究正在進(jìn)行中，研究有待發(fā)表。ARHGAP9基因的低表達(dá)與FAB-M3、FAB-M5相關(guān)；FAB-M3是AML中預(yù)后最好的類型，長期生存可達(dá)正常健康人的水平，在該類型中，ARHGAP9基因均低表達(dá)，可能與該類型的發(fā)病機(jī)制相關(guān)；ARHGAP9基因的高表達(dá)與FAB-M1相關(guān)。在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，ARHGAP9的高表達(dá)與正常核型及復(fù)雜核型相關(guān)。預(yù)后分層研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因的低表達(dá)與AML良好預(yù)后相關(guān)，而ARHGAP9基因的高表達(dá)與AML中等預(yù)后相關(guān)。預(yù)后分層的結(jié)果與FAB-M1亞型及復(fù)雜核型患者的不良預(yù)后結(jié)果一致。在AML的突變基因中，ARHGAP9的表達(dá)與常見的突變類型如FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TP53I不相關(guān)。但是因?yàn)榛蛲蛔兊臄?shù)據(jù)較少，可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本課題通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與AML患者的細(xì)胞與細(xì)胞黏附、白細(xì)胞增殖、移動(dòng)、分化等生物學(xué)功能呈正相關(guān)，與MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT信號(hào)通路呈正相關(guān)。有研究表明ARHGAP9對(duì)Cdc42和Rac1具有GAP活性，而對(duì)RHOA無此作用，蛋白質(zhì)相互作用分析表明ARHGAP9與Cdc42、Rac1及RHOA有相互作用，說明ARHGAP9可以通過RHOA發(fā)揮作用。除了充當(dāng)RhoGAP發(fā)揮小G蛋白活化酶的作用外，ARHGAP9還可以通過WW域與絲裂原激活的蛋白激酶相互作用[5]。這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因在AML患者體內(nèi)表達(dá)水平較高，而且其高表達(dá)可導(dǎo)致不良預(yù)后。所以推測(cè)ARHGAP9基因可通過MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT等信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞黏附和白細(xì)胞增殖、移動(dòng)、分化等生物學(xué)功能，最終導(dǎo)致AML不良預(yù)后。提示ARHGAP9基因可能是AML的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，可以作為AML靶向治療的潛在靶點(diǎn)。