抗生素治療對胚胎反復著床失敗合并子宮內膜炎患者妊娠結局的影響

李潔，肖卓妮，李雪瑤，丁錦麗，趙璟，管楓，楊亦青，楊菁*

(1.武漢大學人民醫院生殖醫學中心 湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430000；2.武漢大學人民醫院病理科，武漢 430000)

近年來，隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技術的發展，輔助生殖技術臨床妊娠率有了較大的提高，胚胎能否著床成功是妊娠的關鍵環節，其中有15%～20%左右的患者出現反復著床失敗(recurrent implantation failure，RIF)，他們承受著生理、心理及經濟的巨大負擔。RIF病因涉及到卵母細胞及胚胎質量、植入胚胎數量、子宮內膜容受性，以及母胎界面免疫因素等方面，如何提高RIF患者胚胎著床率為臨床亟需解決的熱點問題，近年來有研究發現子宮內膜炎在RIF患者中發生率較高并逐漸引起關注。

慢性內膜炎(Chronic endometritis，CE)是子宮內膜間質內異常漿細胞滲出導致的局部的持續炎性疾病，患者通常無明顯臨床癥狀或者僅伴有輕微下腹不適、白帶增多，盆腔隱痛或痛經等。雖然CE臨床無明顯癥狀，但嚴重影響了女性生殖健康。有研究報道在不孕患者中CE發生率為 2.8%～56.8%[1-2]，在RIF患者中的發生率則達到14%～30.3%[3-4]，這些研究結果提示CE與妊娠結局密切相關。本研究主要觀察CD138標記漿細胞在RIF患者子宮內膜中浸潤的情況，對合并CE的RIF患者進行抗生素治療后再次評估漿細胞表達，并評估行凍融胚胎移植(FET)患者的妊娠結局，旨在探討抗生素治療對RIF合并CE患者行FET后妊娠結局的影響。

資料和方法

一、研究對象

選取2018年1月至2019年12月在武漢大學人民醫院生殖中心行IVF/ICSI-ET助孕的RIF患者為研究對象。納入標準為：(1)40歲以下，至少經歷2次新鮮或FET周期，且累計移植≥4 枚優質胚胎仍未獲臨床妊娠[5]；(2)夫婦雙方染色體核型均正常，(3)女方彩超提示子宮形態及內膜厚度正常，無內分泌疾病，無血液高凝傾向。排除標準：(1)子宮解剖結構異常；(2)患有自身免疫性疾病；(3)患者BMI>29 kg/m2或<18 kg/m2。

本研究已經通過了我院倫理委員會的倫理審查，納入患者均簽署了知情同意書。

二、研究方法

1.子宮內膜標本收集：所有患者在黃體中期經陰道B超確定子宮內膜為分泌期形態，使用一次性子宮內膜取樣器(江蘇嘉鼎誠醫療器械)收集少量子宮腔內膜組織，經鹽酸緩沖液(PBS)漂洗，于10%中性甲醛固定后行蘇木精伊紅(HE)染色、常規組織病理學檢查及CD138免疫組化檢查。

2.CE診斷：根據CD138免疫組化染色結果判定，以高倍鏡視野下發現≥5個CD138+標記的漿細胞為陽性[6]，計數30個高倍鏡視野。若陽性視野數≥3個為強陽性，陽性視野數1～2個為弱陽，鏡下僅見到1～4個CD138+標記的漿細胞或未見到漿細胞浸潤，為非CE組，即對照組。

3.CE治療：對于CE陽性患者給予口服鹽酸多西環素(江蘇聯環藥業)100 mg 2次/日 ×14 d 和甲硝唑(金日制藥)500 mg 3次/日×14 d，療程結束后再次在黃體中期取內膜行CD138免疫組化檢測判斷治療效果。

4.分組：根據抗生素治療后患者CE轉歸情況分為CE持續陽性組(n=5)、CE弱陽組(n=27)、CE轉陰組(n=82)及非CE組(n=217)組，除持續強陽性組外，其余3組進行胚胎移植。

5.胚胎移植內膜準備：(1)GnRH-a 降調節+激素替代周期：月經第2～3 天肌肉注射 GnRH-a醋酸亮丙瑞林微球注射液(抑那通，武田，日本)3.75 mg，28 d后給予戊酸雌二醇片(補佳樂，拜耳，德國)，4～6 mg/d，根據內膜厚度調整用藥劑量及用藥時間，內膜厚度在 7 mm 及以上后給予患者肌肉注射黃體酮油劑40 mg/d(浙江仙琚)轉化內膜，第 4天或第6天行卵裂期胚胎移植或囊胚移植。

6.胚胎移植及黃體支持：按照玻璃化解凍常規對胚胎進行解凍、復蘇。卵裂期優質胚胎為：卵裂球數量為 7～12 個，細胞大小符合發育階段，碎片<10%，無多核化現象；優質囊胚評分在3BB 以上[7]。常規在 B 超引導下行優質胚胎移植，卵裂期每次移植不超過2枚胚胎，囊胚建議單囊胚移植。移植后每天給予黃體酮油劑40 mg/d肌肉注射及口服地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg，2次/日，進行黃體支持至孕10周左右。

7.妊娠判斷：卵裂期胚胎移植12 d或囊胚移植10 d后查血HCG，HCG≥10 U/L為HCG陽性，移植30 d后經陰道超聲檢查見孕囊為臨床妊娠，陰道超聲檢查發現異位妊娠或患者HCG升高但宮內未見孕囊為異位妊娠，孕28周之前的胚胎丟失記為流產。

8.觀察指標：(1)患者一般情況包括年齡、體質量指數(BMI)、竇卵泡計數(AFC)、抗苗勒管激素(AMH)、不孕年限、不孕類型、既往移植周期數、移植日內膜厚度、移植胚胎個數；(2)移植周期妊娠結局包括HCG陽性率、臨床妊娠率、著床率、異位妊娠率、流產率、活產率。HCG陽性率=HCG陽性周期數/凍融周期數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/凍融周期數×100%；著床率=孕囊數/移植胚胎數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；流產率=胚胎丟失周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=活產分娩數/凍融胚胎移植周期數×100%

三、統計學處理

結 果

一、RIF患者中CE的檢出及治療情況

在2018年1月至2019年12月期間，我們共納入觀察 331 例RIF患者，經CD138免疫組化染色進行CE確診，發現114例患者合并CE，檢出率為34.44%(114/331)，其中CE呈強陽性患者占 25.98%(86/331)，CE呈弱陽性患者占8.46%(28/331)；CE陰性者共217例，占65.56%(217/331)。

114例CE陽性患者經抗生素治療后再次在黃體期取子宮內膜行CD138免疫組化檢測結果顯示5例患者持續強陽性，27例患者為弱陽性，82例患者轉為陰性。其中86例RIF合并CE強陽性患者有59例轉為CE陰性，占 68.60%(59/86)；有22例患者CE轉為弱陽性，占25.58 %(22/86)；CE持續強陽患者為5例，占5.81%(5/86)。28例RIF合并CE弱陽性患者經抗生素治療后有23例轉為CE陰性，占 82.14%(23/28)；有5例患者持續呈弱陽性，占17.86%(5/28)。根據治療及檢查情況將除持續強陽性外的患者分為3組，詳細分組流程見圖1。

圖1 RIF患者分組流程

二、3組患者的臨床基本資料

分析3組患者基礎資料顯示，3組患者的年齡、BMI、AFC、AMH、不孕類型、既往移植周期數差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者基本資料比較[M(P25，P75)，n(%)]

三、3組患者胚胎移植情況及妊娠結局

統計結果顯示，3組患者行FET的周期移植胚胎個數及移植日內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)；妊娠結局比較中，與CE弱陽組比較，CE轉陰組的HCG陽性率、臨床妊娠率、著床率及活產率均顯著升高(P<0.01)，非CE組的HCG陽性率及著床率均顯著升高(P<0.05)；非CE組臨床妊娠率及活產率高于CE弱陽組，但差異尚無統計學意義(P>0.05)；CE轉陰組與非CE組相比，HCG陽性率、臨床妊娠率和流產率均顯著升高(P<0.05)，而臨床著床率和活產率無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 三組患者凍胚移植臨床妊娠結局比較[M(P25，P75)，%]

討 論

RIF一直是輔助生殖臨床工作的熱點問題，近年來臨床上為改善原因不明RIF的妊娠結局，而逐步完善的治療策略有個體化促排方案、實驗室質量控制、移植方法的改進、以及免疫調節藥物的使用[8]、宮腔內注射粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)[9]、自體外周血單核細胞(autologous peripheral blood mononuclear cells，PBMC)[10]或淋巴細胞主動免疫治療、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)灌注[11-12]、子宮內膜容受性芯片檢測[13]等等，但仍然有患者面臨反復著床失敗的困擾。最近有報道顯示CE通過改變子宮內膜容受性影響胚胎著床，研究者認為女性子宮內膜間質本身存在一定量的漿細胞，但異常表達的漿細胞可能導致CE，從而影響胚胎植入，其機制可能為微生物感染宮腔釋放致病原，導致子宮內膜上皮細胞、基質細胞和血管上皮細胞異常表達趨化因子和粘附因子，擾亂子宮內膜微環境。且外周血B細胞進入子宮內膜基質，一部分B細胞在基質內分化為漿細胞，另一部分B細胞遷移進入子宮內膜上皮和腺腔中，使子宮內膜窗口期發育延遲且子宮內膜容受態性相關基因及因子表達下降，降低子宮內膜容受性，導致胚胎著床失敗[14]。此外有多項研究報道CE與IVE-ET妊娠結局密切相關[3，15-16]。

目前CE的診斷方法主要包括宮腔鏡檢查[17]、病理學HE染色結合CD138免疫組化法[18]、病原學培養[19]或測序[20]。CE在宮腔鏡下表現為子宮內膜間質水腫、散在的直徑小于1 mm的微小息肉、不規則的子宮內膜增厚以及伴發局部點狀或彌漫性子宮內膜充血。病理檢查可發現子宮內膜間質中存在異常漿細胞，但常規的HE染色是根據形態學尋找漿細胞，容易漏掉圓形漿細胞和紡錘形漿細胞，并且存在一定程度的主觀判斷偏差，影響CE的診斷。跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖配體蛋白聚糖1即CD138是漿細胞特異性標志物之一，有效彌補HE染色形態學檢查的不足，可將子宮內膜間質漿細胞的檢出率由6%上升至52%[21]。子宮內膜病原學檢查可發現主要致病菌為鏈球菌屬、大腸桿菌屬、糞腸桿菌屬，其次為支原體[14]。這些檢查方法為CE診斷提供了有益幫助，尤其CD138免疫組化法具有較高的靈敏度且便于開展，已廣泛應用于臨床上。

目前國內外對于應用CD138免疫組化的方法診斷CE的標準尚未完全統一，Bouet等[3]認為每10個高倍鏡下子宮內膜間質中存在至少5個漿細胞可診斷為CE，其在RIF中檢出率為14%，Cicinelli等[19]認為只要每張切片上有一個漿細胞出現，就可診斷為CE，其檢出率為56.8%，Kitaya等[14]發現在278例具有正常生育功能的女性中，48.6%的女性子宮內膜間質中也存在一個以上的漿細胞，但多小于5個，而327例RIF中58.4%的患者子宮內膜間質中有漿細胞的存在，其中大于5個的有35.5%，提出需計算子宮內膜間質漿細胞密度大于等于0.25 情況下，可診斷CE，其發生率為34%。因此，以鏡下見到CD138陽性漿細胞數還是子宮內膜間質漿細胞密度作為CE診斷標準，暫無共識，并且，內膜間質中CD138陽性的漿細胞有多少個需要進行治療，目前尚無統一標準。本研究參考Zargar等[6]研究方法，以高倍鏡視野下發現≥5個CD138+標記的漿細胞為陽性，且計數30個高倍鏡視野，≥5個CD138+標記的漿細胞視野數≥3個為強陽性，≥5個CD138+標記的漿細胞視野數1～2個為弱陽性，鏡下僅見到1～4個CD138標記的漿細胞或未見到漿細胞浸潤，為陰性及非CE。本文CE強陽性、弱陽性及非CE，其在RIF中發生率分別為25.98%，8.46%，65.56%。

CE主要是因為宮腔內微生物感染所引起，臨床上主要根據宮腔內細菌培養或微生物檢測結果來進行針對性治療，控制原發感染。然而，由于宮腔液體及子宮內膜細菌培養或微生物檢測存在較大的局限性，目前臨床對于RIF合并CE多采用經驗性抗生素治療。多西環素抗菌譜廣泛，對支原體、革蘭氏陽性球菌和陰性桿菌均有效，多項研究認為多西環素是治療CE的一線藥物，已被用于臨床，并取得較好療效推薦使用[4，22-23]。因此，本研究采用多西環素及針對厭氧菌的甲硝唑聯用治療CE，療程結束后再次行黃體期子宮內膜CD138免疫組化檢測結果顯示5例患者持續強陽性，27例患者轉為弱陽，82例患者轉陰，轉陰率為71.93%(82/114)。5例持續強陽性患者未行胚胎移植，27例弱陽患者、82例CE轉陰患者、以及217例非CE患者再次行凍融胚胎移植的臨床結局分析顯示，經過治療后CE轉陰組HCG臨床妊娠率及活產率得到明顯改善，差異有統計學意義。但CE轉陰組早期流產率較高，因此對于RIF仍需考慮胚胎因素，可行胚胎移植前遺傳學檢測。

綜上，CE是導致RIF的重要因素，建議完善相關檢查，病理學檢查結合CD138免疫檢測可提高檢出率。同時本研究發現，CE陽性患者給予抗生素治療后轉陰可改善RIF患者臨床妊娠結局，倡議多中心大樣本研究CE鏡下診斷標準的確立，避免遺漏或過度治療。對于持續陽性者可考慮行子宮內膜菌群培養或DNA測序技術，以查明感染的病原微生物類別，有助于臨床抗生素的精準使用。