廣西部分地區蛇源性細菌的耐藥性分析

張美晨，陶 飛，白慧麗，李常挺，曾 蕓

（廣西大學動物科學技術學院 530004 ）

蛇敗血癥的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、腸道沙門氏菌、枸櫞酸桿菌和鮑曼不動桿菌，正常情況下，糞腸球菌在蛇的消化道內其菌群維持在一定的平衡狀態，通常是不會引起發病的[1]，但是當蛇由于病毒或細菌感染引起免疫功能下降時，糞腸球菌就會成為條件性致病菌，也會感染蛇，引起蛇發病[2]。細菌產生耐藥性，通常是由于產生滅活藥物的酶類、改變藥物作用的靶位或降低細胞膜的通透性等[3]。在長期使用抗菌藥物的狀態下，致病菌主要是由于基因突變或細菌間耐藥基因的轉移產生耐藥性[4]，而后者是目前致病菌產生耐藥性的最重要因素[5]。目前，蛇源性致病細菌的研究較少，其耐藥情況尚不明確。從廣西各地的蛇敗血癥病例中分離獲得的細菌呈現不同程度的耐藥，本文通過體外抑菌試驗結合耐藥基因檢測，了解并掌握引起蛇發生敗血癥的細菌及其耐藥性情況，觀察蛇類中是否已出現“多重耐藥性細菌”[6]，為細菌感染的合理防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細菌來源

2016年7月到2017年7月，廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室從廣西各地蛇場送檢的蛇敗血癥病例中分離純化出7種23株細菌，分別編號為A、B、C、D、E、F、G，如表1。

表1 細菌種類

1.2 體外抑菌試驗

將細菌分別接種于適宜的培養基，37℃恒溫培養24 h，用細菌間接計數的麥氏比濁法配制菌懸液濃度為3×109cfu/mL，采用紙片法進行體外抑菌試驗[7]，每株細菌每個藥物做三個平行，按照臨床和實驗室標準化委員會(CLSI)的標準進行結果判定，抑菌圈直徑(Φ)＜10 mm為不敏感，即耐藥(R)，10 mm≤Φ＜15 mm為低敏或不敏感，即中敏(I)，Φ≥15 mm為敏感(S)。

1.3 耐藥基因檢測

根據體外抑菌試驗結果，總結出分離得到的細菌對常用抗菌藥物所耐受的種類，并根據各類藥物及各種細菌的常檢耐藥基因，篩選出最終所用的耐藥基因，并設計相關引物，具體引物名稱、序列及退火程序見表2，引物由廣州金唯智生物科技有限公司合成。將同種細菌分為一組，每組根據對應的耐藥基因的PCR反應條件分別進行擴增。PCR反應體系(50 μL):2×TaqMaster Mix(Dye)，25μL；ddH2O，17μL；上、下游引物(10μmol/L)各2μL；DNA模板，4μL。PCR反應結束后進行凝膠電泳(120v 100mA，25min)并觀察擴增結果。

表2 耐藥基因檢測所用引物

2 結果與分析

2.1 體外抑菌試驗結果

7種23株細菌的體外抑菌結果如表3所示。按藥物分類分別對這7種細菌進行單因素方差分析，結果為不同細菌對β-內酰胺類、氨基糖苷類和大環內酯類藥物的耐藥性差異極顯著P＜0.01（α=0.05），而對四環素類和喹諾酮類藥物的耐藥性沒有顯著差異。

表3 7種23株細菌的體外抑菌試驗結果(單位：mm)

表中同種細菌不同株的相同藥物的體外抑菌試驗結果取平均值。

2.2 耐藥基因檢測結果

通過電泳凝膠成像儀得到各產物的電泳圖像（圖1），由圖可知A組中5株來源不同的肺炎克雷伯菌中A1、A3、A5這三株菌檢測到耐氨基糖苷類藥物的耐藥基因aac(3)-Ⅱ，這與2.1中肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗生素中的慶大霉素和鏈霉素表現為耐藥相符合。C組中8株來源不同的糞腸球菌，只有C2、C5兩株菌檢測到erm(B)耐大環內酯類藥物的目的基因，這與上述糞腸球菌對大環內酯類抗生素中的紅霉素和泰樂菌素表現為耐藥相符合。D組中2株來源不同的腸道沙門氏菌中D1株檢測到SUL1耐磺胺類藥物的目的基因，這與上述藥敏試驗結果不符合，但仍能表示該株菌含有耐藥基因。其余細菌均未檢測到相應的耐藥基因。

圖1 耐藥基因PCR反應結果

3 討論

廣西各地送檢的蛇敗血癥病例共19例，且送檢前的用藥情況不同，其中部分用過多西環素和土霉素，部分用過阿莫西林和恩諾沙星，其余的還用過氟苯尼考進行治療，但療效均不佳。經過剖檢及細菌分離，從病例中共分離獲得7種23株細菌，即8株糞腸球菌、5株肺炎克雷伯菌、3株鮑曼不動桿菌、3株普羅威登斯菌、2株腸道沙門氏菌、1株枸櫞酸桿菌、1株摩氏摩根菌。從體外抑菌試驗結果來看，肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類抗生素耐藥，糞腸球菌對大環內酯類抗生素耐藥，普羅威登斯菌對β-內酰胺類抗生素耐藥，腸道沙門氏菌對恩諾沙星耐藥，枸櫞酸桿菌對頭孢拉啶耐藥，摩氏摩根菌對青霉素和頭孢拉啶耐藥，不同細菌對不同抗菌藥的耐藥趨向表現無規律，但有普遍發展的趨勢[8]。

從耐藥基因檢測結果來看，檢測到的耐藥基因有一定的代表性。糞腸球菌易對大環內酯類藥物產生耐藥性[9]，其中對紅霉素的耐藥性最為嚴重，一般采用檢測與紅霉素相關的甲基化酶基因erm(A)、erm(B)、erm(C)來斷定耐藥機制，通常erm(B)基因的陽性檢出率最高。本次試驗所用到的8株糞腸球菌，其耐藥基因erm(B)的陽性檢出率為25%(2/8)，這與黃震等人關于糞腸球菌對泰利霉素藥物敏感性與耐藥基因erm的分布[10]的研究不符，可能是由于樣本數量過少。細菌對氨基糖苷類藥物產生耐藥性，通常是由于其產生了氨基糖苷類鈍化酶，而這類酶又分為磷酸轉移酶(APH)、核苷轉移酶(ANT)和乙酰轉移酶(AAC)[11]。其中在耐氨基糖苷類藥物的細菌中，最易檢出AAC，而在耐氨基糖苷類藥物的肺炎克雷伯菌中，最易檢出的耐藥基因為aac(3)-Ⅱ[12]。本次試驗所用到的5株肺炎克雷伯菌，其耐藥基因aac(3)-Ⅱ的陽性檢出率為60%(3/5)，具有一定的代表性。磺胺類藥物的耐藥基因檢測通常包括SUL1、SUL2和SUL3[13]，而本次試驗所用到的2株腸道沙門氏菌則進行了SUL1耐藥基因的檢測，其陽性檢出率為50%(1/2)，說明該耐藥基因已在蛇源性細菌中存在，但與上述體外抑菌試驗結果不符合，可能是由于菌株數量過少，所以不具有統計學意義[14]。其余耐藥基因的檢出率為0，可能是蛇源性細菌還未攜帶或產生該基因，或者是本次試驗中分離到的菌株數量過少所致。但本試驗仍能體現出抗菌藥物的濫用，導致細菌產生耐藥基因的普遍性。