生物膜構(gòu)建密閉環(huán)境下大鼠新鮮創(chuàng)面愈合的實驗研究

尹成國，王業(yè)本，高廣輝，郝作斌，王大釗，王文德

（濟南市第三人民醫(yī)院 手外科，山東 濟南 250132）

皮膚再生技術(shù)是近年來醫(yī)學研究的熱點。國內(nèi)外文獻報道[1-4]，保持環(huán)境濕潤可加速創(chuàng)面愈合速度，減少瘢痕形成；良好的敷料能維持創(chuàng)面內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，避免因頻繁更換敷料破壞再生上皮，影響創(chuàng)面愈合。本研究通過制備SD大鼠全層皮膚缺損模型，采用同體自身對照，比較創(chuàng)面在3 M透明敷貼構(gòu)建的濕潤環(huán)境下與凡士林紗布形成的干燥環(huán)境下愈合特點，為臨床工作提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與主要儀器

實驗動物：雄性SD大鼠40只，8～10周齡，體重210～250 g，購自山東大學實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20130009，使用許可證號：SCXK（魯）20130001。動物自由飲食，飼養(yǎng)于標準動物房內(nèi)。適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后進行實驗。

使用材料：3 M透明敷貼（生物膜），由美國3 M公司生產(chǎn)；凡士林紗布，由華西衛(wèi)材公司生產(chǎn)。

主要儀器：流式細胞計數(shù)儀 (Beckman Colter公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 動物分組與建模

建模：選取健康成年雄性SD大鼠40只，采用同體自身對照，水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，按3 mL/kg的劑量給藥。使用電動剃刀剃毛備皮（大鼠背部），面積約7.0 cm×5.0 cm。常規(guī)消毒并鋪無菌單，選擇背中部脊柱兩側(cè)各旁開0.5 cm處制備直徑2.0 cm創(chuàng)面，深達皮下深筋膜層，壓迫止血（圖1）。

圖1 大鼠模型制作，脊柱兩側(cè)各制作直徑約2.0 cm全層皮膚缺損創(chuàng)面

模型建立后，右側(cè)創(chuàng)面應(yīng)用3 M透明敷貼（觀察組）覆蓋并固定，左側(cè)創(chuàng)面以凡士林油紗覆蓋(對照組)并固定，清潔紗布包扎，次日開始每日換藥1次，每次換藥應(yīng)用生理鹽水沖洗創(chuàng)面，創(chuàng)面覆蓋物不予清理，酒精消毒創(chuàng)面周圍皮膚。

術(shù)后第3、7、14天隨機選取10只大鼠，換藥時觀察創(chuàng)面大體情況，留取標本行HE染色，剩余10只大鼠每日換藥至創(chuàng)面完全上皮化（21d）。

1.3 創(chuàng)面大體觀察

創(chuàng)面愈合率：術(shù)后第7、14天換藥，創(chuàng)面表面用無菌透明薄膜覆蓋，根據(jù)印記記錄面積，再用計算機圖像分析儀測定其面積。計算創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)／原始創(chuàng)面面積×100%。

記錄術(shù)后第3、7、14天創(chuàng)面組織水腫及出血情況，有無分泌物、創(chuàng)面與敷料有無粘連、創(chuàng)面有無結(jié)痂及創(chuàng)周有無紅腫；記錄大鼠創(chuàng)面最終愈合（創(chuàng)面完全上皮化）時間、愈合時皮膚色澤、彈性及瘢痕程度。

1.4 標本采集與檢測

標本采集：術(shù)后第7、14天換藥時分別于每只大鼠兩個創(chuàng)面中央取材，制做石蠟切片，HE染色。

標本檢測：觀察兩個時間節(jié)點大鼠兩組創(chuàng)面的病理組織愈合情況，根據(jù)改良病理組織學愈合標準給各組大鼠創(chuàng)面愈合情況評分[5]。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料采用平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面大體觀察

術(shù)后第3、7天換藥時觀察組創(chuàng)面無新鮮滲血，表面覆蓋凝膠樣物，與透明敷貼無粘連；對照組出現(xiàn)凡士林紗布與創(chuàng)面粘連、部分形成血痂，更換凡士林紗布時創(chuàng)面有新鮮滲血。術(shù)后第3天，各組未見明顯新鮮肉芽組織。術(shù)后第7天，觀察組創(chuàng)面濕潤，沒有感染跡象；對照組部分創(chuàng)面出現(xiàn)少量分泌物；觀察組創(chuàng)面肉芽組織及邊緣再生上皮均優(yōu)于對照組。術(shù)后第14天，觀察組創(chuàng)面大部分上皮化；對照組創(chuàng)面縮小，上皮生長較觀察組慢。創(chuàng)面最終愈合時觀察組再生皮膚色澤、質(zhì)地、平整度優(yōu)于對照組。

2.2 測算創(chuàng)面面積及最終愈合時間

術(shù)后第7、14天觀察組愈合率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。創(chuàng)面完全上皮化的最終時間觀察組明顯短于對照組，觀察組和對照組平均愈合時間為（16.70±1.60）d和 (18.50±1.36)d(P ＜0.05，表 1）

表1 兩組創(chuàng)面不同時間點愈合率及最終愈合時間比較（±s）

表1 兩組創(chuàng)面不同時間點愈合率及最終愈合時間比較（±s）

組別 創(chuàng)面愈合率（%） 愈合時間（d）第3天 第7天 第14天觀察組 4.50±0.69 31.61±3.20 85.34±2.38 16.70±1.60對照組 3.27±0.55 24.24±1.5475.15±1.59 18.50±1.36 t值 7.648 11.358 19.476-0.469 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 病理組織學觀察

第7天：兩組創(chuàng)面組織均無水腫，對照組仍可見少量出血；第14天：兩組均無出血及水腫，創(chuàng)面邊緣新生上皮明顯。根據(jù)創(chuàng)面表皮結(jié)構(gòu)、真皮-表皮鄰接、膠原束、表皮再生及粒細胞浸潤情況，觀察組在第7天及14天時創(chuàng)面組織病理學評分均明顯高于對照組（表2）。創(chuàng)面完全上皮化時病理切片顯示：觀察組愈合好，鱗狀上皮完全修復(fù)，并且皮膚表面平整；對照組表皮愈合不良，鱗狀上皮高低不平（圖2）。

表2 兩組不同時間點創(chuàng)面組織病理學評分比較（±s）

表2 兩組不同時間點創(chuàng)面組織病理學評分比較（±s）

組別 第7天 第14天觀察組 11.42±1.60 19.41±1.17對照組 9.33±1.57 15.87±1.52 t值 5.106 10.140 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖2 第7、14天生物膜組創(chuàng)面肉芽組織均生長旺盛，有豐富的毛細血管存在，周圍可見成纖維細胞和膠原纖維，創(chuàng)面周圍表皮細胞開始向傷口方向延伸蔓延。第21天兩組創(chuàng)面完全上皮化，其病理切片示：觀察組愈合好，鱗狀上皮完全修復(fù)，并且皮膚表面平整；對照組表皮愈合不良，鱗狀上皮高低不平（HE×100）

3 討論

創(chuàng)面愈合病理變化與皮膚屏障的損害密切相關(guān)，因此使用覆蓋物及時封閉創(chuàng)面成為創(chuàng)傷后治療的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)凡士林紗布等纖維性敷料可使傷口干燥，具備物理隔離功能；但創(chuàng)面滲出液容易結(jié)痂，創(chuàng)面與敷料粘連，換藥時形成新的創(chuàng)傷，不利于皮膚再生[6]。Winter通過動物實驗發(fā)現(xiàn)聚氨酯薄膜敷料密閉包扎可使創(chuàng)面愈合較快些，提出“濕潤傷口愈合”觀念，指出濕性環(huán)境可以促進上皮細胞的爬行，減少瘢痕形成[7-8]。1972年，Rovee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞無法順利通過干燥結(jié)痂的細胞層，而是通過痂皮下的濕潤床緩慢游移，延緩上皮細胞愈合的時間；未結(jié)痂的潤濕傷口，其上皮細胞移行速度明顯快于結(jié)痂創(chuàng)面。2000年8月美國食品與藥品管理局(FDA)在新頒布的創(chuàng)面醫(yī)療用品（外用藥和敷料）的行業(yè)指南中特別強調(diào)，保持創(chuàng)面的濕潤環(huán)境是標準的處理方法[10]。良好的生物敷料能夠促進傷口愈合，主要體現(xiàn)在保持愈合環(huán)境濕潤、低氧或無氧微酸環(huán)境、酶學清創(chuàng)功能、疼痛減輕四方面[6]。3 M透明敷貼是一種生物半透膜，可以觀察傷口滲液情況，且撕除時不傷皮膚。對傷口提供保護環(huán)境，避免細菌、異物的侵入以及外界溫差變化或壓力所造成影響。其構(gòu)建密閉環(huán)境有清創(chuàng)作用，幫助傷口滲液的酶分解壞死組織，保持傷口濕潤的微環(huán)境。

創(chuàng)面修復(fù)過程涉及新生血管及肉芽組織、再上皮化及膠原的產(chǎn)生等與諸多生長因子介導和參與密切相關(guān)[11]。李丹等[12]通過實驗驗證了人創(chuàng)面分泌液對表皮干細胞具有趨化作用，并通過表皮干細胞表達趨化因子介導完成對表皮干細胞的趨化效應(yīng)。3 M透明敷貼構(gòu)建的密閉環(huán)境能夠使?jié)B出液保留于創(chuàng)面周圍，加速上皮再生；創(chuàng)面表面形成凝膠樣物，考慮其內(nèi)富含富血小板血漿(PRP)，含有高濃度的血小板、白細胞和纖維蛋白，血小板激活后能釋放出多種生長因子，可促進細胞的增殖分化，促進軟組織修復(fù)。

前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[13]，3 M透明敷貼治療無骨質(zhì)外露指端軟組織缺損，中期肉芽組織可完全填充缺損，后期肉芽組織逐漸消退、平整，最終愈合皮膚無明顯瘢痕，可恢復(fù)大部分皮紋。干燥環(huán)境下創(chuàng)傷修復(fù)后期，肉芽組織逐漸向瘢痕組織演變，毛細血管、炎細胞逐漸減少，成纖維細胞逐漸成熟，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞[14]。炎癥反應(yīng)則是創(chuàng)面修復(fù)的始動環(huán)節(jié)，但過度的炎癥反應(yīng)亦使創(chuàng)面持續(xù)惡化、壞死，最終導致組織修復(fù)不良[15]。成纖維細胞是創(chuàng)面愈合的主要功能細胞，創(chuàng)面形成后，成纖維細胞進入局部增殖、分化、合成和分泌膠原蛋白；若傷口內(nèi)存有血腫、壞死組織、異物或細菌時，成纖維細胞的移行和新生血管的形成都將延遲[16]。因此要促進創(chuàng)面愈合，就必須為成纖維細胞發(fā)揮其活性功能和作用創(chuàng)造一個良好的環(huán)境。動物實驗研究表明[17]，創(chuàng)面在相對密閉、濕潤環(huán)境下能夠誘發(fā)釋放多種生長因子參與創(chuàng)面修復(fù)、調(diào)節(jié)創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細胞及新生血管的分布，從而加速創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。本研究結(jié)果顯示在創(chuàng)面愈合過程中肉芽組織生長速度觀察組明顯高于對照組，進一步證實3M透明敷貼構(gòu)建密閉環(huán)境能促進血管生成，促進創(chuàng)面愈合。

本研究表明，3M透明敷貼構(gòu)建密閉環(huán)境能有效保護創(chuàng)面凝膠樣物，并能誘發(fā)釋放多種生長因子參與創(chuàng)面修復(fù)，明顯縮短大鼠新鮮創(chuàng)面愈合時間，減少瘢痕形成，為臨床應(yīng)用于指端或小面積皮膚缺損提供理論支持。而具體作用機制有待進一步研究和探討。