外源一氧化氮對鋁脅迫下黑麥草幼苗生長和生理的影響

張漢林，王琳，吳亞，王棟麟，劉大林

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學農業科技發展研究院(國際聯合實驗室)，江蘇 揚州 225009)

近年來，隨著生活水平日益提高，畜產品需求量不斷增加，飼草飼料短缺嚴重[1]。多花黑麥草(Loliumperenne)是一種疏叢型禾本科牧草，其產草量高，營養價值高，家畜適口性佳，是優秀的牧草品種，常見利用方式有青料飼喂、曬制干草和青貯飼料等[2]。發展南方牧草種植具有巨大需求，然而我國南方地區土壤偏酸性，酸性土壤的鋁毒害是限制黑麥草生長的一個重要因素。土壤中游離的Al3+增多，對草本植物的生長有嚴重影響。研究表明，植物的農藝性狀和抗氧化酶系統等在鋁脅迫下均受到抑制[3-4]。

一氧化氮是一種植物體內的氣態自由基信號，廣泛存在植物體細胞內和細胞間，調節植物生長和各種生理變化過程[5]。NO在干旱、重金屬、鹽類等非生物脅迫下作為關鍵信號分子，某些酶的活性受NO的調度[6]。此外，NO能促進原生根和側根的生長，調節氣孔運動以及光介導的綠化，促進光合作用，加快細胞運輸，提高植物對非生物脅迫的抵御能力[7-8]。常見的NO供體主要有硝普鈉(SNP)、硝酸鹽、嗎多明及其代謝物，Diazeniumdislate類(NONOates)、S-亞硝基硫醇類、介離子三噁唑類和偶氮二醇烯鎓鹽類等也被用作新型的NO供體[9-10]。其中SNP較為常用，有研究表明玉米[11]、小麥[12]、黃瓜[13]、棉花[14]、煙草[15]等在漬水脅迫下對其有響應。

本研究以黑麥草為材料，探究外源NO對鋁脅迫下黑麥草幼苗生長和生理的影響，以期為酸性土壤地區種植黑麥草提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

鋁敏感型黑麥草Nagahahikari和鋁耐受型黑麥草特高，由揚州大學動物科學與技術學院草業科學種子庫提供。

1.2 試驗設計

本研究采用沙培法，直徑20 cm的加侖盆，沙子裝進盆內，分別將2種黑麥草種子播種其中，播深2 cm，播種后置于光照培養箱，設置恒溫25℃，光照度10 000 lux，光照14 h、黑暗10 h交替變化，每周施加100 mL Hoagland營養液，培養2周后間苗，每盆保留50株長勢一致的幼苗。

試驗設置6個處理：CK：100 mL蒸餾水；T1：100 mL處理液，含有100 μmol/L的SNP；T2：100 mL處理液，含有200 μmol/L的SNP；T3：100 mL處理液，含有20 mmol/L Al3+(Al3+由AlCl3·H2O提供)；T4：100 mL處理液，含有20 mmol/L Al3+和100 μmol/L的SNP；T5：100 mL處理液，含有20 mmol/L Al3+和200 μmol/L的SNP，每個處理組3次重復。6種處理液分別連續施用3 d，繼續培養至7 d進行采樣，測定各項形態指標和生理指標。

1.3 測定指標與方法

采樣后用直尺(精確到0.1 cm)測量株高和根長，然后將樣品植株分別置于105℃烘箱殺青30 min后65℃烘干至恒重，用分析天平稱量(精確到0.000 1)其干重(DW)，即為地上生物量和地下生物量。

乙醇浸泡法測定葉綠素含量，浸泡法測定相對電導率(EL)，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，蒽酮法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，氮藍四唑染色法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以上指標測試參考施海濤[16]的測定方法。用過氧化物酶(POD)測試盒(南京建成生物工程研究所)比色法測POD活性。用過氧化氫酶(CAT)測試盒(南京建成生物工程研究所)比色法測CAT活性。參考張立軍[17]的方法測可溶性糖含量。參考賀建華等[18]的方法測鋁離子含量。

采用PAM2500(Heinz Walz GmbH)對黑麥草葉片的葉綠素a熒光瞬態曲線進行測定，計算量子產率和效率以及比能量通量,使用Yusuf等[19]描述的JIP測試方法和計算公式分析OJIP瞬時曲線。

1.4 數據分析

用Excel 2003進行數據處理，ANOVA法進行統計分析，Duncan法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫下添加外源NO對黑麥草幼苗生長特征的影響

添加NO后，2種黑麥草幼苗地上和地下部分的伸長生長受到促進，生物量增加(圖1)。與CK組相比，T3組2種黑麥草的株高、根長、地上生物量和地下生物量的增加均受到抑制。Nagahahikari的根長、地上生物量和地下生物量分別降低28.68%、30.43%和25.59%；黑麥草特高的根長、地上生物量和地下生物量分別降低22.92%、13.51%和17.66%。T4組和T5組黑麥草受到的鋁脅迫毒害均有緩解。T4組兩種黑麥草根系的伸長生長較CK分別顯著提高34.21%和31.97%(P<0.05)。相較于T4組，T5組2種黑麥草地上生物量和地下生物量提高更多。

圖1 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的生長特性Fig.1 Effects of exogenous NO addition on the growth characteristics of ryegrass seedlings under aluminum stress注：不同小寫字母表示不同濃度外源物之間即CK、T1、T2之間、T3、T4、T5之間存在顯著性差異(P<0.05)，“*”表示無鋁脅迫組和有鋁脅迫組之間即CK與T3、T1與T4、T3與T5存在顯著性差異(P<0.05)，“**”表示無鋁脅迫組和有鋁脅迫組之間即CK與T3之間、T1與T4之間、T3與T5存在極顯著差異(P<0.01)，下同

2.2 鋁脅迫下添加外源NO對黑麥草幼苗葉綠素含量的影響

與CK組相比，T3組2種黑麥草的葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總量在鋁脅迫下顯著降低(P<0.05)(圖2)。Nagahahikari的葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總量分別降低31.37%、39.13%和39.13%，特高分別降低22.75%、33.60%和33.60%。相較于T3組，T4組和T5組2種黑麥草葉綠素a含量和葉綠素總量顯著提高(P<0.05)，葉綠素b含量無顯著性升高(P>0.05)。

圖2 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的葉綠素含量Fig.2 Effects of exogenous NO addition on the chlorophyll content of two ryegrass seedlings under aluminum stress

2.3 鋁脅迫下外源NO對黑麥草幼苗葉綠素熒光特性的影響

T1組2種黑麥草的葉綠素熒光強度高于T2和CK組2種黑麥草的葉綠素熒光強度。T4組和T5組2種黑麥草的葉綠素熒光強度高于T3組(圖3)。

圖3 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的OJIP熒光瞬態曲線Fig.3 Effects of exogenous NO addition on OJIP fluorescence transient curves of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

與CK組相比，T3組Nagahahikari的Fo、Fj、Fi、Fm和F300μs值在鋁脅迫處理下極顯著降低(P<0.01)。T3組特高的Fj、Fi、Fm和F300μs值與CK組相比極顯著降低(P<0.01)。T4組和T5組Nagaha-hikari的Fo、Fj、Fi、Fm和F300μs值較T3組均顯著提高(P<0.05)。相比T3組，特高的F0(0.02 ms)在T4組和T5組都顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 由OJIP曲線上提取的葉綠素熒光強度數據

T2組Nagahahikari的φEo、δRo、ψEo、RC/ABS和yRC值顯著提高(P<0.05)(表2)。T1組和T2組特高的RC/ABS和yRC值較CK組顯著提高(P<0.05)。與CK組相比，T3組Nagahahikari的φpo、φEo和ψEo值顯著降低(P<0.05)。T4組和T5組Nagahahikari的φEo和ψEo值均顯著提高(P<0.05)，T5組黑麥草Nagahahikari的RC/ABS和yRC值顯著提高(P<0.05)。T5組特高的φpo、RC/ABS和yRC值顯著提高(P<0.05)，而T4組僅φpo值顯著提高(P<0.05)。

表2 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的量子產率和效率

T2組Nagahahikari的ABS/RC和ETo/RC值顯著降低(P<0.05)，但REo/RC值顯著提高(P<0.05)(表3)。T2組特高的ABS/RC、TPo/RC、ETo/RC和REo/RC值顯著提高(P<0.05)。與T3組相比，T4組Nagahahikari的TPo/RC、ETo/RC和REo/RC值顯著升高(P<0.05)。T5組Nagahahikari的ABS/RC、TPo/RC和ETo/RC值顯著降低(P<0.05)。

表3 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的比能量通量

T2組，兩種黑麥草的性能指標顯著提高(P<0.05)，其中Nagahahikari和特高的PIABS值分別增加9.25%和12.42%，PItotal值分別增加28.54%和16.84%(圖4)。與T3組相比，T5組Nagahahikari的PIABS和PItotal值顯著提高(P<0.05)，T4組和T5組特高的PIABS值均顯著提高(P<0.05)，而T5組特高的PItotal值顯著提高(P<0.05)。

圖4 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的性能指標Fig.4 Effects of exogenous NO addition on the performance indexes of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

2.4 鋁脅迫下添加外源NO對黑麥草幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

添加外源NO的T1組和T2組相比CK組，2種黑麥草可溶性糖含量升高，T2組Nagahahikari和特高的可溶糖含量提高，分別為41.55%和90.42%(圖5)。與CK組相比，T3組2種黑麥草的可溶性糖含量提高，其中Nagahahikari的可溶性糖含量極顯著高于CK組(P<0.01)，而特高無顯著性變化。與T3組相比，T4組和T5組2種黑麥草的可溶性糖含量增加，T5組Nagahahikari的可溶性糖含量顯著高于T3組(P<0.05)。

圖5 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量Fig.5 Effects of exogenous NO addition on the soluble sugar and soluble protein content of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

T3組Nagahahikari的可溶性蛋白含量相較于CK組降低，而特高的可溶蛋白含量顯著高于CK組(P<0.05)。T4組和T5組Nagahahikari的可溶性蛋白含量提高，特高的可溶蛋白含量降低。

2.5 鋁脅迫下外源NO對黑麥草幼苗過氧化指標的影響

與CK組比較，T3組2種黑麥草的相對電導率極顯著提高(P<0.01)。與T3組相比，T4組和T5組2種黑麥草的相對電導率顯著降低(P<0.05)，其中T5組Nagahahikari和特高的相對電導率分別降低34.85%和27.35%。

T3組相較于CK組，2種黑麥草的MDA含量極顯著提高(P<0.01)，Nagahahikari和特高的MDA含量分別增加2.75倍和2.29倍。與T3組相比，T4組和T5組2種黑麥草的MDA含量顯著降低(P<0.05)。

圖6 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的過氧化指標Fig.6 Effects of exogenous NO addition on peroxidation indexes of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

2.6 鋁脅迫下外源NO對黑麥草幼苗抗氧化酶活性的影響

T3組2種黑麥草的SOD活性均極顯著高于CK組(P<0.01)。T4組和T5組2種黑麥草的SOD活性較T3組顯著提高(P<0.05)，其中T5組2種黑麥草的SOD活性相較于T3組分別提高28.66%和37.18%。

T3組2種黑麥草的POD活性均極顯著高于CK組(P<0.01)。T4組和T5組2種黑麥草的POD活性較T3組顯著提高(P<0.05)，其中T5組2種黑麥草的SOD活性相比T3組分別提高52.41%和50.30%。

與T3組相比，T5組Nagahahikari的CAT活性顯著提高(P<0.05)，T4組和T5組特高的CAT活性均有顯著提高(P<0.05)。

2.7 鋁脅迫下添加外源NO對黑麥草幼苗Al3+富集含量的影響

與CK組相比，T2組特高地上部的Al3+富集量顯著降低(P<0.05)(圖8)，其根系的Al3+富集含量降低，但差異不顯著(P>0.05)。T4組和T5組2種黑麥草地上部和根系中的Al3+富集量較T3組降低，T5組Nagahahikari地上部和根系中的Al3+富集量減少，分別為34.95%和26.02%，特高地上部和根系中的Al3+富集量減少，分別為29.33%和17.37%。

圖7 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗的抗氧化酶活性Fig.7 Effects of exogenous NO addition on antioxidant enzyme activities of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

圖8 鋁脅迫下添加NO黑麥草幼苗不同部位的鋁富集含量Fig.8 Effects of exogenous NO addition on the aluminum content in different parts of the seedlings of two ryegrass cultivars under aluminum stress

3 討論

一氧化氮(NO)是一種重要的氣體信號分子[20]。NO能夠提高植物對非生物脅迫的抵抗性能，如低溫脅迫[21]、鹽脅迫[22]、高溫與干旱脅迫[23]、重金屬脅迫[24]和酸鋁脅迫[25]等。番茄等植物幼苗的生長在適宜濃度的NO下受到促進[26-27]。Tian等[28]研究表明豌豆葉片膨大與適宜濃度的NO處理相關。本研究發現，對鋁脅迫下的黑麥草添加NO，其株高和根長增加，地上和地下部分生物量增加。這與對大豆[29]、小麥[30]、煙草[31]等研究的結果一致。由此可見，對鋁脅迫下黑麥草添加NO，能促進其生長。相同處理組中，特高的株高、根長、地上生物量和地下生物量均高于Nagahahikari，可能是特高本身對于鋁脅迫有較好的耐受性，受到鋁毒害的影響較小，在添加NO后生長有更明顯的改善。

葉綠素含量與植物光合作用的強度具有密切的關聯。研究發現，鋁脅迫下，兩種黑麥草葉片中葉綠素各組分的含量均顯著降低。鋁脅迫下的黑麥草，葉綠體受損，酶的結構發生變化，從而抑制葉綠素的合成[32-33]可能是造成此結果的原因。Fv/Fm參數(光化學的最大量子產量)不具有特異性[34]，通常對植物的逆境脅迫響應不大[35]。因此，使用快速葉綠素a熒光動力學對黑麥草的光合性能進行評價。熒光猝滅的分析可評價黑麥草的光合性能，反映黑麥草對鋁脅迫的耐受性，還可反映PSⅡ中能量流動和電子輸運的狀況[36-37]。研究發現，對鋁脅迫下的黑麥草進行添加NO處理，其葉綠素a熒光強度提高。鋁脅迫下黑麥草添加NO，黑麥草特高的Fo值降低，2種黑麥草的Fm值都提高，黑麥草的量子產率和效率提高，比能量通量降低，表現為葉綠素a熒光動力學性能提高。Pltotal與植物生長和生理參數間有強相關性[38]。研究發現，對鋁脅迫下黑麥草添加200 μmol/L的NO，能使其Pltotal顯著上升。由此可知NO能保護黑麥草的光合系統。其中特高的各項光合性能指標均優于Nagahahikari，表明鋁耐受型黑麥草對鋁脅迫有較好的適應性，同時Nagahahikari的光合性能指標提升幅度大于特高，表明添加NO對于鋁敏感型黑麥草的光合系統有更好的保護效果。

可溶性糖和可溶性蛋白調節植物細胞液濃度、改變細胞滲透勢的物質，也能為細胞提供能量或作為酶類物質，在應對非生物脅迫的過程中發揮重要作用[39-40]。研究發現，對鋁脅迫下黑麥草添加200 μmol/L的NO，2種黑麥草的可溶性糖含量均提高，可溶性蛋白含量均下降。可能是由于鋁脅迫下黑麥草分解可溶性蛋白提供能量。黑麥草特高可能因為對鋁脅迫具有較好的耐性，2種滲透調節物質含量提高，以維持細胞滲透勢，提高細胞吸水或保水能力。

MDA的積累損傷膜系統，質膜透性變差，電解質外泄，最終導致相對電導率上升。研究發現，鋁脅迫顯著提高2種黑麥草的MDA含量和相對電導率。由此可見黑麥草細胞在鋁脅迫下易發生過氧化。植物清除體內ROS主要通過SOD，POD和CAT等抗氧化酶類，以此維持ROS的產生和清除的平衡。研究發現，鋁脅迫下2種黑麥草的3種抗氧化酶活性顯著升高，可能是因為鋁脅迫使黑麥草體內產生更多ROS，提高抗氧化酶活性以更快地清除ROS，更快適應鋁脅迫環境。鋁脅迫下2種黑麥草添加NO后，SOD、POD和CAT活性提高，MDA含量和EL值也因此降低。

研究發現，黑麥草特高地上和地下部分都比黑麥草Nagahahikari富集的鋁少，說明特高通過減少Al3+在其體內富集實現更好的鋁耐性。鋁脅迫下對2種黑麥草進行添加NO處理，使地上和地下部分中的鋁富集量均有降低。由此可見，鋁脅迫下對黑麥草進行添加NO處理，能降低黑麥草對Al3+的吸收和富集，減輕鋁脅迫對黑麥草的毒害，促進黑麥草的生長，提高黑麥草的生物量。

4 結論

鋁脅迫下對黑麥草進行添加NO處理，使其光合性能提高，滲透調節能力提高，膜脂過氧化程度降低，抗氧化酶活性提高，鋁富集量降低，黑麥草實現了更好的生長，更多的生物量積累。添加NO提高了黑麥草對鋁脅迫的適應能力，緩解了鋁脅迫對黑麥草的毒害作用。此外，相比于鋁耐受性黑麥草特高，添加SNP對鋁敏感型黑麥草Nagahahikari有更明顯的鋁毒害緩解效果。