廣西壯族哮喘人群5-HTT基因rs3794808位點多態性與CD4+T淋巴細胞因子平衡的關系研究①

蒙明慮 許建國 陳高 馬迎教（右江民族醫學院公共衛生與管理學院，百色533000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥、氣道壁重塑和氣道高反應性疾病，是一種嚴重危害人類健康的身心疾?。?］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病的發病機制存在關聯，且與5-羥色胺轉運體（5-HTT）基因多態性的功能作用有關［2-3］。以往研究發現哮喘的高氣道反應主要是由免疫功能障礙引起，其中CD4+T淋巴細胞4個亞群：輔助性T細胞Th1、Th2、Th17和調節性T細胞Treg起著至關重要的作用，Th細胞因子的異常表達、Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡是哮喘發病的免疫學機制［4-5］。為探討廣西壯族哮喘人群的5-HTT基因rs3794808位點多態性是否通過影響CD4+T淋巴細胞因子的平衡進而影響哮喘的發病，本研究采用病例對照研究方法，觀察rs3794808位點多態性對CD4+T淋巴細胞因子平衡狀態的影響，為5-HTT基因參與哮喘發病機制的研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料將廣西西部地區三甲醫院收集的221例壯族哮喘患者作為病例組，以208例壯族健康體檢者作為對照組。全部調查對象均在廣西長期生活、三代均為壯族、未與其他民族通婚，均簽署知情同意書。本研究通過右江民族醫學院醫學倫理委員會審批（倫理審查號2017030501）。哮喘診斷標準符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的《中國支氣管哮喘防治指南》［6］，病例組排除標準：①上呼吸道功能不全，慢性阻塞性肺疾病（COPD），氣管軟化等引起的喘息及合并其他呼吸系統疾?。虎趪乐匦难芗膊?、嚴重肝腎功能不全等其他系統的嚴重疾??；③合并自身免疫系統疾病、惡性腫瘤等疾病。對照組是常規體檢的健康人，近1個月內無急性上呼吸道感染、胸部X線檢查未見異常、無哮喘病史及典型過敏史、無自身免疫性疾病史。

共收集病例組221例，其中男性113例（51.1%），女性108例（48.9%），年齡24~85歲，平均年齡（53.21±13.88）歲；對照組208例，其中男性105例（50.5%），女性103例（49.5%），年齡20~89歲，平均年齡（53.13±15.91）歲，兩組性別、年齡差異均無統計學意義（χ2=0.018，P=0.893；t=0.058，P=0.954），資料具有可比性。

1.1.2 試劑及儀器基因分型在北京六合華大基因科技有限公司完成；細胞因子檢測試劑購自TaKaRa公司；基因擴增儀ETC811購自東勝創新生物科技有限公司；DNA測序儀購自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 標本收集抽取外周靜脈血5 ml，經乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝，其中1 ml血標本用于提取DNA，4 ml血標本用于血清細胞因子水平的檢測。

1.2.2 基因組DNA提取1 ml抗凝血全用于提取DNA，使用TaKaRa公司人全血基因組DNA試劑盒提取DNA，嚴格按照說明書步驟提取DNA，分裝置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.3 基因分型采用SNP的PCR重測序法對rs3794808位點進行基因分型。PCR擴增上游引物：5'-CTAACCCAGGCTCCTCA-3'，下 游 引 物：5'-TC‐GCTTTACCCTCATCT-3'。PCR擴增反應體系：DNA模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，BGI 2×Su‐per PCR Mix 15 μl；RNase-free H2O 12 μl（總反應體積30 μl），配好反應體系后基因擴增儀上執行以下反應程序：96℃預變性5 min；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共10個循環；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃延伸5 min，反應完成后，將反應物4℃保存。將DNA擴增產物用于測序。測序反應體系為：2 μl Mix（Big‐dye3.1、5×sequencing buffer、H2O），2 μl純 化 后 的PCR產物，1 μl引物（5 mmol/L）。測序反應程序為：循環條件為：95℃15 s→（95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s）×35個循環，反應完成后，將反應物4℃保存，用ABI 3730XL型DNA測序儀進行測序，部分測序結果，見圖1。

1.2.4 細胞因子水平檢測采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平，所有試劑均購于TaKaRa公司，整個過程嚴格按照說明書步驟操作。

1.3 統計學分析采用GraphPad Prism 5.0統計分析軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗分析；符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，兩獨立樣本t檢驗進行兩組間均數比較，以單因素方差分析進行多組間均數比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組人群SNP位點基因分型及等位基因頻率病例組及對照組的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗（χ2=1.067，P=0.893；χ2=0.002，P=0.967），說明兩組人群均具有代表性；病例組和對照組在rs3794808的基因型頻率和等位基因頻率差異均有統計學意義（P<0.05）；如圖1、表1。

表1 兩組人群5-HTT基因rs379808位點基因型及等位基因頻率的比較［頻數（%）］Tab.1 Comparison of polymorphism distribution of locus rs3794808 of 5-HTT gene in two groups［Frequen?cy（%）］

圖1 5-HTT基因rs3794808位點5-3′UTR測序結果Fig.1 Direct sequencing graph of locus rs3794808 at 5-3'UTR of 5-HTT gene

2.2 5-HTT基因多態性與哮喘的關聯性分析5-HTT基因rs379808位點CT基因型與TT基因型差異無統計學意義（P>0.05），CC基因型、CT+CC基因型與TT基因型差異有統計學意義（P<0.05），CC基因型發生哮喘的危險度是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），C等位基因患哮喘的風險是T等位基因的1.608倍（95%CI：1.136~2.276）。見表2。

表2 5-HTT基因rs379808位點基因型的相對危險度分析Tab.2 Relative risk analysis of locus rs3794808 of 5-HTT gene

2.3 兩組人群細胞因子水平比較病例組血清中的IFN-γ和IL-10水平低于對照組，而IL-4和IL-17水平明顯高于對照組；與對照組相比，病例組的IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高，差異均有統計學意義（P<0.001）。見表3。

表3 兩組人群血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

表3 兩組人群血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

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2.4 病例組中不同基因型哮喘患者細胞因子水平的比較攜帶不同基因型的哮喘患者血清中各細胞因子水平差異均有統計學意（P<0.001）；多重比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中IFN-γ和IL-10的濃度較低，而IL-4和IL-17的濃度較高，IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高；CT基因型哮喘患者與TT基因型哮喘患者相比較，血清中IL-17較低，IL-17/IL-10較高。見表4、圖2。

圖2 不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

Note：Multiple comparisons，there were significant differences between CC and TT，CT and TT genotypes，1）P<0.001.

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3 討論

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病，由于無法完全治愈、反復發作且普遍存在焦慮、抑郁等精神問題，哮喘患者患精神性疾病的風險更高［7-8］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病之間存在共同的遺傳易感性，重度抑郁的多基因風險評分（PRS）與兒童哮喘風險升高有關［9-10］，以往研究表明，體內5-HTT基因表達減少會增加哮喘和抑郁的風險［3］，5-HTT基因Stin2多態性與臺州地區漢族人群哮 喘 的發 生 呈顯 著 相關［11］，雖 然5-HTT基 因rs3794808位點與哮喘的關系鮮有報道，但有研究證實該位點與抑郁等精神性疾患有關聯［12］，而哮喘又是一個典型的心身疾病，因而該位點與哮喘的關系值得探討和研究。本課題組在前期研究中發現，5-HTT基因rs3794808位點多態性可能是壯族人群哮喘發病的潛在遺傳易感性標志，5-HTT作為免疫調節劑，參與了炎癥反應過程，與哮喘發作有關［13］。為了探討5-HTT基因rs3794808位點與哮喘的關系是否通過調節細胞因子網絡發揮免疫調節作用，本研究進行了病例對照研究，發現5-HTT基因rs3794808位點CC基因型和C等位基因是壯族人群哮喘發病的危險因素，與前期研究結果一致［13］，在此基礎上，通過檢測CD4+T淋巴細胞因子進一步了解5-HTT基因rs3794808位點多態性與Th1/Th2、Th17/Treg平衡的關系。

哮喘的慢性氣道炎癥由多種細胞免疫參與反應，Th1/Th2細胞及其細胞因子失衡是哮喘發病的基礎［14］。在正常機體中，IFN-γ和IL-4互相拮抗，維持Th1/Th2平衡，當機體受變應原刺激時，Th1/Th2失衡，Th2占優勢，分泌大量IL-4，抑制IFN-γ活性，促進炎癥介質釋放，使杯狀細胞增生，氣道黏液分泌增多，氣管增厚，導致氣道狹窄而促使哮喘發作［15-16］。Th2細胞分泌的IL-4是慢性炎癥和氣道高反應性的關鍵調節因子，哮喘患者血清的IL-4高于正常對照組，Th1分泌的IFN-γ可抑制輕度和中度哮喘的發作，IFN-γ與哮喘的嚴重程度呈負相關［17］。LIANG等［18］對哮喘小鼠的研究發現，與健康對照小鼠比較，哮喘小鼠的IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，體內Th1/Th2免疫失衡。有報道糖皮質激素通過抑制Notch1信號傳導，調整小鼠哮喘過敏性氣道炎癥中涉及的Th1/Th2平衡從而達到抗炎的目的［19］。本研究發現，與對照組相比，壯族哮喘人群的IFN-γ水平降低而IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4較低，說明Th1/Th2細胞因子免疫失衡參與了壯族人群哮喘炎癥反應的發生。

以往對哮喘的研究主要集中在Th1/Th2細胞免疫失衡，但隨著研究的深入，發現Th1/Th2細胞免疫失衡不足以說明哮喘的炎癥反應，哮喘還與Th17和Treg失衡有關［20］。Th17細胞經過活化后誘導生成IL-17，IL-17會募集中性粒細胞，促進炎癥細胞因子在氣道內的大量表達［21］，導致組織破壞和炎性細胞浸潤，打破體內的穩態平衡，進一步加劇哮喘的發作。Treg細胞分泌TGF-β、IL-10等細胞因子，抑制嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞的活化，減輕Th2細胞因子IL-4的分泌，從而抑制氣道炎癥反應，抑制哮喘的發生。有研究發現哮喘患兒的Th17細胞頻率升高、Th17/Treg升高，而且與氣道高反應性相關，在對兒童及成人哮喘的研究中都觀察到了Th17/Treg細胞因子的失衡，并與成人哮喘病情的嚴重程度有關［22-24］。本次研究發現壯族哮喘人群的IL-10水平比較低，IL-17水平明顯高于對照組，IL-17/IL-10增高，提示Th17/Treg細胞因子在壯族哮喘人群中比例失衡。為哮喘的靶點治療提供理論依據。

本研究顯示5-HTT基因rs3794808位點CC基因型發生哮喘的危險性是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），為了解5-HTT基因型的差異是否影響Th細胞因子平衡，對不同基因型哮喘患者的細胞因子水平的比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中的IFN-γ和IL-10表達下降，IL-4和IL-17表達升高，IFN-γ/IL-4降低及IL-17/IL-10增高，提示5-HTT基因多態性可能與CD4+T淋巴細胞因子的表達有關，有可能通過影響Th1/Th2、Th17/Treg平衡從而影響哮喘的發病，此結果從另一個角度為哮喘機制研究提供了切入點和線索，但其中的復雜機制還有待進一步的研究證實。