系統(tǒng)性紅斑狼瘡誘導(dǎo)多能干細(xì)胞差異蛋白圖譜的鑒定與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析①

秦娟 何慧燕 梁灼健 趙鑫 蔡晚霞 廖秋燕 葉梅 戴勇湯 冬娥

（深圳市人民醫(yī)院（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院）臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東省自身免疫性疾病工程研究中心，深圳518020）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身炎癥性免疫性結(jié)締組織疾病，發(fā)生群體以青年女性為主，可累及多種臟器，患者體內(nèi)形成的大量自身抗體可結(jié)合體內(nèi)抗原生成免疫復(fù)合物沉積于機(jī)體諸多部位，包括腎小球、血管、關(guān)節(jié)與皮膚等，受補(bǔ)體刺激可導(dǎo)致組織壞死與急慢性炎癥，抗體同時可與組織細(xì)胞抗原直接反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞受損，引發(fā)機(jī)體多系統(tǒng)損傷，但其潛在病因尚未闡明。SLE尚無有效治療方法，其治療往往長期廣泛采用免疫抑制劑［1］。為闡明SLE發(fā)病機(jī)制，本研究對SLE患者蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，以確定SLE患者和健康志愿者蛋白表達(dá)差異。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是將特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞后產(chǎn)生的具有無限增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞，iPSCs可從患者自身體細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得，保留疾病基因組遺傳信息，并在體外模擬疾病進(jìn)程和表型。因此，采用iPSCs構(gòu)建的疾病模型在疾病病理機(jī)制探究方面具有應(yīng)用價值，同時可作為細(xì)胞模型篩選藥物靶點(diǎn)［2］。本研究從SLE患者及健康對照者尿液中成功誘導(dǎo)出iPSCs并對其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。

同重同位素相對與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是能夠于一次實(shí)驗(yàn)中開展多個樣品（≤8個）的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，其應(yīng)用范圍基本包括所有蛋白樣品，具備高定量精度優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)組學(xué)定量領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本研究采用iTRAQ技術(shù)鑒定SLE患者的差異表達(dá)蛋白。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象根據(jù)美國風(fēng)濕學(xué)院（ACR）修訂的SLE標(biāo)準(zhǔn)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI）2000，實(shí)驗(yàn)組選取診斷為活動性SLE，并排除3個月內(nèi)使用免疫抑制劑治療的患者［3-4］。對照組選取每年進(jìn)行身體檢查的健康志愿者。所有參與者知情同意，并經(jīng)臨床倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑LTQ-or bitrapX L-htcpalparagnms4系統(tǒng)（北京基因組學(xué)研究所，生政，中國）；范式MS4高效液相色譜泵（michrom Bioresources Inc.，Auburn，Ca，USA）；HTC-Pal自動采樣器（CTC‐Analytics，Zwingen，瑞士）；C18分析柱（內(nèi)徑75 μm，15 cm；L-柱，CERI，Auburn，CA）；LTQ-軌道射線譜儀（熱費(fèi)舍爾科學(xué)，不來梅，德國）；IPI_human v3.87數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞收集和培養(yǎng)收集實(shí)驗(yàn)組患者中段尿50 ml，立即置于4℃保存，并于24 h內(nèi)處理，建立SLE-iPSCs組和對照組iPSCs（NC-iPSCs）并進(jìn)行鑒定［5］。實(shí)驗(yàn)組、對照組各1例。

1.2.2 蛋白定量提取實(shí)驗(yàn)組、對照組總蛋白，進(jìn)行還原烷基化處理、濃度測定、電泳、酶解、iTRAQ標(biāo)記及標(biāo)記后肽段等量混合等，對其進(jìn)行預(yù)分離及液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。①蛋白提取：稱取適量樣品，1 ml PBS洗脫至少30 s，25 000 g離心20 min（4℃），棄上清，重復(fù)以上操作，加入500 μl lysis3溶解，分別添加1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA反應(yīng)5 min，添加DTT至10 mmol/L，200 Watts超聲裂解15 min，25 000 g離心20 min，保留上清，10 mmol/L DTT處理1 h（56℃），還原打開二硫鍵。55 mmol/L IAM處理45 min（暗室中），進(jìn)行半胱氨酸烷基化封閉。加入1 ml冷凍丙酮，-20℃放置過夜。25 000 g離心20 min，棄上清，沉淀在300 μl 0.5 mmol/L TEAB中200 Watts超聲裂解15 min。25 000 g離心20 min，取上清用于定量；②還原烷基化處理，打開二硫鍵以充分酶解蛋白；③2D quant kit法進(jìn)行蛋白濃度測定；④等體積進(jìn)行SDS電泳；⑤酶解蛋白；⑥iTRAQ試劑標(biāo)記肽段：胰蛋白酶消化，真空離心泵抽干肽段，0.5 mmol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記，每組肽段被不同iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2 h，將標(biāo)記后的各組肽段混合，SCX柱進(jìn)行液相分離；⑦將標(biāo)記后的肽段等量混合；⑧混合后的肽段采用強(qiáng)陽離子交換色譜（strong cation ex‐change choematography，SCX）進(jìn)行預(yù)分離；⑨進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with tan‐dem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析質(zhì)譜掃描結(jié)果采用吉祥物服務(wù)器2.3.02版與api_humanv3.87數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 采 用iTRAQ技 術(shù)對SLE-iPSCs和NC-iPSCs進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組檢測共獲得7 415個高質(zhì)量肽，對2 305個蛋白進(jìn)行鑒定與量化，通過皆為1.5倍差異的上調(diào)蛋白、下調(diào)蛋白定義一類蛋白作為不同表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)SLE-iPSCs與NC-iPSCs雙方差異表達(dá)的蛋白共88種，豐度提高26種，SLE-iPSCs庫內(nèi)豐度下降的62種，蛋白豐度差異倍數(shù)>1.5倍，同時P<0.05，可判定為差異蛋白（表1、2）。差異蛋白數(shù)統(tǒng)計(jì)情況見圖1A。在相對定量方面，若2樣本在同一蛋白量方面未見顯著改變，則其蛋白豐度比趨于1。若蛋白豐度比≥1.5倍，同時P<0.05，可將此蛋白視為差異蛋白，顯示以各蛋白差異倍數(shù)底數(shù)為2時所取對數(shù)值相應(yīng)分布狀況（圖1B）。

表1 蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.1 Results of identified proteomic profiling

表2 蛋白定量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Protein quantification statistics

圖1 差異蛋白數(shù)與蛋白豐度分布Fig.1 Differential expression proteins number and pro?tein abundance distribution

2.2 SLE-iPSCs樣本差異蛋白差異蛋白定量分析結(jié)果顯示，共篩選出10個在SLE-iPSCs蛋白譜中表達(dá)顯著上調(diào)的差異蛋白（表3）及10個顯著下調(diào)的差異蛋白（表4）。

表3 SLE-iPSCs樣本上調(diào)蛋白Tab.3 Up-regulated proteins of SLE-iPSCs

表4 SLE-iPSCs樣本下調(diào)蛋白Tab.4 Down-regulated proteins of SLE-iPSCs

2.3 差異蛋白質(zhì)GO分析為深入探究此類蛋白的分子機(jī)能與生物過程，對檢測確定的差異蛋白開展了GO富集分析，對生物體內(nèi)基因與基因產(chǎn)物屬性做出全面描述，結(jié)果顯示，GO分析共含3個本體，分別為分子功能、生物過程、所處位置（圖2）。富集量最大的蛋白分子功能、細(xì)胞組成、生物過程見表5，分子功能方面，蛋白結(jié)合（55.69%）、催化活性（26.87%）及結(jié)構(gòu)分子活性（3.67%）占比較大。細(xì)胞組成方面，富集量最大的幾種蛋白分別位于細(xì)胞（23.98%）、細(xì) 胞 部 分（23.98%）及 細(xì) 胞 器（20.27%）。生物過程方面，細(xì)胞過程（16.63%）、生物代謝過程（13.97%）及生物調(diào)節(jié)過程（7.93%）占比較大。

表5 富集量最大的幾種蛋白分子功能、細(xì)胞組成、生物過程（%）Tab.5 Molecular function，cellular component and biological process of most concentration proteins（%）

圖2 差異表達(dá)蛋白GO分析Fig.2 GO analysis of differential expression proteins

2.4 差異蛋白KEGG通路富集KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網(wǎng)絡(luò)，如代謝通路、復(fù)合物、生化反應(yīng)。與NC-iPSCs相比，SLE-iPSCs差異蛋白KEGG通路富集結(jié)果如圖3所示。不同顏色代表不同P值，點(diǎn)的大小代表差異蛋白量。

圖3 KEGG富集通路Fig.3 KEGG enrichment pathway

3 討論

iTRAQ技術(shù)可于一次實(shí)驗(yàn)中開展多個樣品（≤8個）蛋白質(zhì)組定量，其應(yīng)用范圍基本包括所有蛋白樣品，具備高定量精度優(yōu)勢，在定量蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用日漸廣泛。本研究顯示，SLE-iPSCs與NC-iPSCs存在多個差異表達(dá)蛋白，部分為上調(diào)蛋白，如巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、金屬硫蛋白-1G（metallothionein-1G，MT1G），部分為下調(diào)蛋白，如組蛋白H1，部分與SLE患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)或與自身免疫性疾病病理生理學(xué)機(jī)制相關(guān)。

MIF是首個被發(fā)現(xiàn)擁有多效炎癥介質(zhì)活性的因子，同時是一類發(fā)揮關(guān)鍵作用的內(nèi)分泌激素，擁有變位酶及氧化還原酶活性，多種細(xì)胞均可合成MIF，如T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）、內(nèi)皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞。MIF為多功能趨化因子，不僅在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)活性，同時可經(jīng)自分泌與旁分泌途徑調(diào)節(jié)微環(huán)境。作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，MIF結(jié)構(gòu)具備一定獨(dú)特性，功能類似于趨化因子。自1966年MIF被發(fā)現(xiàn)以來，其在固有免疫、炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞招募等方面研究廣泛。MIF具有促進(jìn)細(xì)胞定向遷移、增強(qiáng)其他炎癥介質(zhì)釋放、提升炎癥反應(yīng)、拮抗糖皮質(zhì)激素、抑制細(xì)胞凋亡等功能，因此與多種炎癥性疾病顯著相關(guān)，包括癌癥、自身免疫性疾病、代謝性疾病、動脈粥樣硬化等［6-7］。

研究表明，具有高表達(dá)MIF等位基因的個體SLE發(fā)病率降低，但終末器官并發(fā)癥患者高表達(dá)MIF等位基因頻率提高，即MIF對SLE發(fā)病具有影響，高表達(dá)MIF等位基因降低SLE易感性，可能通過增強(qiáng)自身免疫病原體清除實(shí)現(xiàn)［8］。但一旦SLE發(fā)展，低表達(dá)MIF等位基因保護(hù)器官免受炎癥損傷，說明MIF對SLE患者免疫發(fā)病影響具有雙重作用。研究顯示，與對照組相比，SLE患者M(jìn)IF水平顯著升高，此結(jié)果與本研究結(jié)果相似［9］。此外，SLE患者活動期血清MIF含量較靜止期顯著升高，同時MIF上升程度與SLEDAI顯著相關(guān)［10］。SLE屬于自身免疫性疾病，患者體內(nèi)T細(xì)胞活化與B細(xì)胞克隆激活分泌出眾多自身抗體。MIF則為前炎癥介質(zhì)，可由機(jī)體多種組織細(xì)胞生成，SLE患者體內(nèi)大部分MIF由活化的T細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞合成。研究證實(shí)，采用特異性抗原刺激T細(xì)胞，核糖核酸因MIF信使表達(dá)上調(diào)，蛋白分泌量大幅提高，表明MIF在SLE患者B細(xì)胞抗體生成與T細(xì)胞活化方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。本研究顯示，SLE患者M(jìn)IF蛋白高表達(dá)，證實(shí)MIF與SLE患者病情高度相關(guān)。

本研究中，SLE-iPSCs樣本MT1G表達(dá)明顯上調(diào)，此蛋白在生物體內(nèi)大量分布，且內(nèi)含半胱氨酸，可與多種重金屬離子小分子量可溶性蛋白結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)具有關(guān)鍵生物功能，維持機(jī)體內(nèi)必需金屬離子穩(wěn)定，抑制重金屬離子損傷機(jī)體組織器官與機(jī)能，清除機(jī)體在多種刺激因素作用下或正常代謝下產(chǎn)生的自由基，影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，抑制細(xì)胞凋亡。機(jī)體應(yīng)激、細(xì)胞因子與損傷等因素均可誘導(dǎo)MT表達(dá)［12］。MT可顯著抑制機(jī)體因T細(xì)胞所致的體液免疫反應(yīng)［13］。炎癥產(chǎn)生的細(xì)胞因子可通過胞內(nèi)信號機(jī)制促進(jìn)MT基因表達(dá)，與機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下MT基因表達(dá)升高結(jié)果一致，MT表達(dá)增多可能是機(jī)體為恢復(fù)免疫動態(tài)平衡、減少炎癥損傷的一種反饋性保護(hù)機(jī)制［14］

本研究中，MT1G表達(dá)顯著上調(diào)，說明在SLE患者自身免疫過程中，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生大量自身抗體，從而大幅度促進(jìn)MT1G合成，但目前尚未文獻(xiàn)報道，但本研究中差異表達(dá)的MT1G可能成為SLE的輔助診斷和監(jiān)測指標(biāo)。本研究采用iPSCs與iTRAQ技術(shù)鑒定SLE-iPSCs、NC-iPSCs間蛋白表達(dá)差異，得到SLE-iPSCs顯著升高、降低的蛋白，同時針對此類差異蛋白功能開展GO分析發(fā)現(xiàn)，MIF與SLE患者發(fā)病相關(guān)，并與SLE患者疾病活動期狀態(tài)相關(guān)。MT1G則與自身免疫疾病病程相關(guān)，多個自身免疫疾病患者體內(nèi)MT1G高表達(dá)，這2種蛋白有望成為SLE患者診斷及病情監(jiān)測的標(biāo)志物。