超高效液相色譜串聯質譜法測定甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度評定

羅志榮，龐揚海，黃敏興*，曾秋霞，高裕鋒

(1廣東省科學院生物與醫學工程研究所，廣東廣州510316；2中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

甘蔗富含糖分，是我國最主要的制糖原料，也是人們喜愛食用的水果之一[1-4]。甘蔗的收成季節正值冬春季，尤其是在春季，雨水多，濕度大，甘蔗儲存不當容易霉變，產生3-硝基丙酸(3-NPA)。3-硝基丙酸是一種神經性毒素，可損害人體中樞神經系統，低劑量攝入人體后，即可致嘔吐、暈眩、抽搐、昏迷，甚至死亡[5-7]，因此對甘蔗中3-硝基丙酸的準確測定要求較高。目前3-硝基丙酸的檢測方法有液相色譜法[8]和液相色譜串聯質譜法[9]，相對于色譜法，質譜法靈敏度更好，準確性更高。為檢查分析結果質量、度量分析結果可信性，有必要對甘蔗中3-硝基丙酸進行不確定度評定。通過不確定度評定，可以有效分析檢驗過程中影響結果準確性的因素，提出降低結果不確定性的方法[10]。

本文參照胡重怡等[11]建立的甘蔗中3-硝基丙酸的超高效液相色譜串聯質譜法，對甘蔗樣品中3-硝基丙酸進行檢測。根據國家計量技術規范JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[12]的要求對測量結果的不確定度進行評定，通過建立數學模型對各個不確定度分量進行計算，找出影響甘蔗中3-硝基丙酸檢測準確性的主要因素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：AB 5500 Q-Trap超高效液相色譜串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Multi Reax多位渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)；CL5R大容量冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；SB25-12 DTD超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UPC-I-60L型超純水機(成都超純科技有限公司)。

主要試劑：甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，德國默克公司)；甲酸(分析純，廣州化學試劑廠)；氨水、氯化鈉(分析純，廣州化學試劑廠)；3-硝基丙酸(99.99%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；PSA固相萃取柱(6 mL，500 mg，美國Waters公司)。

1.2 測定方法

稱取2 g甘蔗試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻，超聲20 min，加入5 g氯化鈉，混合均勻后，超聲10 min，10000 r/min離心5 min，收集上清液；用6 mL乙腈活化PSA固相萃取柱，將10 mL上清液過柱，用10 mL 1%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用0.5%甲酸水溶液定容至5.0 mL，過濾膜，用于UPLC-MS/MS分析。

2 建立數學模型

通過對一系列已知濃度的3-硝基丙酸標準溶液的測定，根據測定的一系列響應峰面積，儀器自動以最小二乘回歸法作出濃度-峰面積標準曲線，見公式⑴和公式⑵。

式中：A-峰面積；c-濃度；b-斜率；a-截距。

式中：w-樣品中3-硝基丙酸的質量分數，μg/kg；ci-待測溶液中3-硝基丙酸的質量濃度，μg/L；V-樣品定容體積，mL；m-樣品質量，g；n-重復測定次數。

3 測量甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來源分析

測量不確定度是與測量結果緊密關聯的參數，能夠合理地賦予被測值的分散性，而該分散性主要包括A類不確定度、B類不確定度和合成不確定度。根據數學模型和測量過程，甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來源包括(如圖1所示)：①稱樣過程引入的不確定度urel(m1)，來源于電子天平的精度；②樣品定容過程引入的不確定度urel(V)，來源于定容容器的體積誤差和讀數誤差；③3-硝基丙酸標準物質稱量引入的不確定度urel(m2)，來源于電子天平的精度；④3-硝基丙酸標準物質純度引入的不確定度urel(c)；⑤標準溶液引入的不確定度urel(b)，來源于稀釋過程溶液移取器皿和定容容器的體積誤差和讀數誤差； ⑥標準曲線擬合的不確定度urel(l)；⑦測量甘蔗中3-硝基丙酸產生的不確定度urel(n)，來源于重復性測量引入的不確定度。

圖1 測定甘蔗中3-硝基丙酸含量的不確定度來源

4 不確定度分量評定

4.1 樣品稱量的不確定度urel(m1)

樣品稱量使用精度為0.01 g的電子天平，稱樣量為2.00 g，查天平檢定證書，U=0.02，k=2，相對不確定度為urel(m1)=0.02/2.00/2=5.00×10-3。

4.2 樣品定容引入的不確定度urel(V)

按照JJG 196-2006《常規玻璃量器檢定規程》[13]的規定，5 mL A級單標線吸量管容量允差為±0.0015 mL，按照矩形分布，不確定度為0.0015/=8.66×10-3；定容時估讀誤差±0.005 mL，引起的不確定度0.005/=2.89×10-3，其相對不確定度為：

4.3 3-硝基丙酸標準物質稱量引入的不確定度urel(m2)

3-硝基丙酸標準物質稱量使用精度為0.00001 g的電子天平，稱樣量為0.01000 g，查天平檢定證書，U=0.00003，k=2，其相對不確定度為urel(m2)=0.00003/2/0.01000=1.50×10-3。

4.4 3-硝基丙酸標準物質純度引入的不確定度urel(c)

3-硝基丙酸標準物質證書中給出的純度為99.30%，標準不確定度為±0.05%，k=2，因此相對不確定度為：urel(c)=0.05/2/99.30=2.52×10-4。

4.5 標準溶液引入不確定度urel(b)

⑴配制3-硝基丙酸標準儲備液產生的不確定度：稱量0.01000 g 3-硝基丙酸標準物質，用甲醇溶解，并用10 mL(V0)容量瓶定容，得到1000 μg/mL的標準儲備液。

⑵配置標準使用液產生的不確定度：在本實驗中，標準工作曲線的濃度分別為20、10、5、1、0.5、0.1 μg/L。以10 μg/L標準溶液配制過程為例：用1 mL移液管準確吸取 3-硝基丙酸標準儲備液(1000 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(100 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(10 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到1 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(1 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/L標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(100 μg/L)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/L標準溶液。3-硝基丙酸標準溶液濃度計算公式如式⑷所示。

其中：c1-3-硝基丙酸標準溶液濃度(10 μg/L)；c-3-硝基丙酸標準儲備液濃度(1000 μg/mL)；V移1-1 mL移液管的體積；V移2-1 mL移液管的體積；V移3-1 mL移液管的體積；V移4-1 mL移液管的體積；V移5-1 mL移液管的體積；V容1-10 mL容量瓶的體積；V容2-10 mL容量瓶的體積；V容3-10 mL容量瓶的體積；V容4-10 mL容量瓶的體積；V容5-10 mL容量瓶的體積；1 mL移液管和10 mL容量瓶的相對標準不確定度urel(V3)計算結果見表1，其相對不確定度見式⑸。

表1 移液管、容量瓶的相對標準不確定度分量

4.6 標準曲線最小二乘法擬合引入的不確定度urel(l)

制備3-硝基丙酸標準曲線，配制的6個標準濃度，分別平行進樣測定2次，峰面積見表2，擬合曲線方程為y=5954.1x+1898.6，因此a=1898.6，b=5954.1。發霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量重復測 定數據見表3(n=10)。

表2 標準曲線峰面積-濃度值

表3 某發霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量測定結果(n=10)

樣品中3-硝基丙酸平均濃度c0,=30.44 μg/L，計算得到甘蔗中3-硝基丙酸含量為152.20 μg/kg。標準溶液平均濃度為ˉc=(1+5+10+20+50+100)/6=31.0 μg/kg。urel(l)的計算公式為式⑹，殘差標準差S計算公式為式⑺，x的離差平方和Sxx計算公式為式⑻。

其中：n-測試標準溶液的次數，n=12；p-測試樣品的次數，p=10；c-各個標準溶液濃度的平均值，c=31.0 μg/kg；c0,-樣品濃度的平均值，c0,=30.44 μg/L；b-標準曲線斜率，b=593.7；a-標準曲線截距，a=217.7；i-下標，第幾個標準溶液；j-下標，獲得標準曲線的測量次數。代入數值計算得到urel(l)=4.59×10-3。

4.7 重復測量引入的不確定度urel(n)

單次測量標準不確定度為：

實際測量時在重復性試驗條件下獨立測定樣品10次(2個平行)的平均值作為檢測結果，平均值為30.44 μg/L，因此測量重復性引入的標準不確定度為：

因此相對標準不確定度為：

4.8 計算合成相對標準不確定度

各個不確定度分量計算值見表4，樣品標準溶液配制和重復性測定引入的不確定度是不確定度的主要來源。合成相對標準不確定度為：

表4 甘蔗中3-硝基丙酸測定相對不確定度分量評定結果

4.9 擴展不確定度表示方法

合成標準不確定度為uc=uc,rel×w=3.82×10-2×152.20=5.81 μg/kg。在95%置信水平下，包含因子取k=2，擴展不確定度為U=k×uc=2×5.81=11.62 μg/kg。實際甘蔗樣品的測定結果可表示為(152.20±11.62) μg/kg，k=2。

5 結論

超高效液相色譜串聯質譜法測定甘蔗中3-硝基丙酸含量的過程中，影響3-硝基丙酸測定結果的不確定度主要來源為標準工作曲線的配制和重復性測定。因此優化標準曲線配制的步驟和規范前處理減少重復誤差是減小不確定度的有效方法。