辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆和表達(dá)分析

楊 磊，朱彤彤，劉應(yīng)保，夏 帆，孫文秀

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó) 荊州 434025)

由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是一種重要的土傳病害，防治困難，對(duì)全球多種蔬菜作物生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，辣椒作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積日益擴(kuò)大，辣椒疫病的發(fā)生也愈加嚴(yán)重[1]。疫霉菌屬于卵菌，其菌絲無隔膜，細(xì)胞壁主要成分是纖維素，且在整個(gè)生命周期中都是以二倍體存在[2]，與真菌存在明顯的差別，導(dǎo)致市場(chǎng)上多種防治真菌的化學(xué)藥劑無法對(duì)疫霉菌產(chǎn)生作用，也就達(dá)不到防治卵菌病害的目的。

磷脂酶D(phospholipase D, PLD)是一種普遍存在于真核生物中的磷脂水解酶，通常有兩個(gè)高度保守的催化基序，這些基序由HxKxxxxD組成(簡(jiǎn)稱HKD1和HKD2)，它們對(duì)于磷脂酶D的催化活性是必需的[3，4]。磷脂酶D參與調(diào)節(jié)植物和真菌的多種生理過程，涉及植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)和真菌的有性生殖及致病力[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中Spo14/PLD的缺失能夠抑制孢子減數(shù)分裂過程中子細(xì)胞膜的形成，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)孢量的下降[10]。禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)FgPLD1敲除突變體菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，產(chǎn)孢量減少，致病力明顯減弱[11]。致病疫霉菌(P.infestans)磷脂酶D分為6個(gè)亞家族，其中sPLD-likes和PLD-likes類磷脂酶D是致病疫霉菌的致病因子[12]。

目前，真菌磷脂酶D的研究報(bào)道較少，對(duì)于卵菌的相關(guān)研究則更少。本研究從辣椒疫霉菌LT1534中分離鑒定到1個(gè)磷脂酶D基因，命名為PcPLD8。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在辣椒疫霉菌不同發(fā)育時(shí)期和侵染時(shí)期的表達(dá)情況，并在本氏煙上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)接種測(cè)定其致病性，這些結(jié)果將為進(jìn)一步研究磷脂酶D在辣椒疫霉菌致病過程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株辣椒疫霉菌LT1534保存于本實(shí)驗(yàn)室。pEASY-T3載體、常用感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α、農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101及Blue Plus?Protein Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DL2000 Plus DNA Marker，2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)，ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)及HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)購(gòu)自諾唯贊生物公司。Total RNA Kit I和E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司。EndoFree Plasmid Mini Kit購(gòu)自CWBI公司。植物表達(dá)載體pBIN-GFP2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竇道龍教授惠贈(zèng)。

試驗(yàn)植株本氏煙(Nicotianabenthamiana)和辣椒(實(shí)驗(yàn)室自交系品種06221)，溫室16 h光照/8 h黑暗種植，在24 ℃左右恒溫培養(yǎng)。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

在辣椒疫霉菌LT1534基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，以釀酒酵母SPO14/PLD氨基酸序列通過BLAST搜索得到PcPLD8(JGI登錄號(hào): 568375)基因。以辣椒疫霉菌cDNA為模板，采用特異性引物PcPLD8F(5′-TCCCCCGGGATGGACGGACTTAGTCGCG-3′)/PcPLD8R(5′-CGCGGATCCGTTGTCACCCTCGACGTCC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：25 μL 2×Phanta Max Master Mix，4 μL DNA，17 μL ddH2O，2 μL Forward Primer (10 μmol·L-1)，2 μL Reverse Primer (10 μmol·L-1)，共50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收特異條帶，連接到克隆載體pEASY-T3，菌落PCR驗(yàn)證，陽性克隆送青島擎科生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過在線軟件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)；利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；通過TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；利用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；通過CELLO軟件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用ClustalW軟件對(duì)PcPLD8與6類致病疫霉PLD進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利用MEGA6.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 樣品制備與總RNA提取

分別收集辣椒疫霉菌LT1534的營(yíng)養(yǎng)菌絲(MY)、孢子囊(SP)、游動(dòng)孢子(ZO)、休止孢(CY)和萌發(fā)的休止孢(GC)，取LT1534游動(dòng)孢子懸浮液(2×104個(gè)/mL)20 μL滴加于辣椒葉片上，25 ℃保濕靜置培養(yǎng)，在接種后0，1.5，3，6，12，24，48，72 h分別收取樣品，具體方法參考文獻(xiàn)[13]。采用Total RNA Kit I試劑盒提取辣椒疫霉菌LT1534不同發(fā)育時(shí)期樣品和侵染后辣椒葉片的總RNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈，具體步驟參考文獻(xiàn)[14]。設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(見表1)，以cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)說明書進(jìn)行操作，以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR Green Mix，上下游引物各0.4 μL，cDNA 4 μL，加水補(bǔ)足至20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。具體操作參考文獻(xiàn)[15，16]。重復(fù)3次，PcPLD8基因的相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)

利用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和BamH I將PcPLD8基因和載體pBIN-GFP2雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，陽性克隆送青島擎科生物技術(shù)公司測(cè)序。采用凍融法將重組植物表達(dá)載體pBINGFP2:PcPLD8轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，接種于液體LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)20 h，離心收集菌體，用緩沖液(10 mmol·L-1MES, 10 mmol·L-1MgCl2, 200 mmol·L-1AS)重懸菌體，調(diào)節(jié)OD600值為0.5，在4～6周齡的本氏煙葉片上進(jìn)行接種，以pBIN-GFP2作為空白對(duì)照，重復(fù)3次，每次至少15片葉片[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆

圖1 辣椒疫霉菌PcPLD8基因的克隆Fig. 1 Cloning of PcPLD8 gene from P. capsici

以辣椒疫霉菌LT1534 cDNA為模板，用特異性引物PcPLD8-F/PcPLD8-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明，在1 500 bp左右有一條特異性條帶，與預(yù)期大小相符(見圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，PcPLD8基因CDS為1 596 bp，編碼531個(gè)氨基酸(見圖2)。

2.2 PcPLD8基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)PcPLD8基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為60 689，理論pI值為4.85。SignalP 5.0信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，該基因不含信號(hào)肽。在線軟件TMHMM分析發(fā)現(xiàn)，PcPLD8無跨膜區(qū)。NCBI和InterPro在線分析結(jié)果顯示，該蛋白具有兩個(gè)典型的HKD結(jié)構(gòu)域(見圖2方框)，屬于PLD超家族蛋白。CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，PcPLD8可能位于細(xì)胞質(zhì)。

通過MEGA6.0將PcPLD8與已報(bào)道的釀酒酵母SPO14/PLD(NP_012956.3)、禾谷鐮刀菌FgPLD1(FGSG_09917)、FgPLD2(FGSG_01973)、FgPLD3(FGSG_06175)、擬南芥PLD(NP_188194.1)、亞洲棉PLD(KHG24518.1)、致病疫霉中的PXPH-PLD (PITG_03651)、PXTM-PLD (PITG_00284)、TM-PLD (PITG_16798)、sPLD-like-A (PITG_18185)、sPLD-like-B (PITG_12806)、PLD-like (PITG_00291)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)PcPLD8與PITG_00291進(jìn)化關(guān)系最近，蛋白序列相似性為94.54%(見圖3)，這說明PcPLD8屬于PLD-like磷脂酶D亞家族蛋白。

圖3 不同物種PLD系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of PLD in different species

2.3 PcPLD8基因在辣椒疫霉菌不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PcPLD8基因在辣椒疫霉菌生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。由圖4可以看出，PcPLD8在辣椒疫霉菌不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升—下降—上升的總體趨勢(shì)，在GC(孢子萌發(fā))時(shí)期急劇升高達(dá)到最大值。

圖4 PcPLD8在辣椒疫霉菌發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Expression level of PcPLD8 during the developmental stages of P. capsici

2.4 PcPLD8基因在辣椒疫霉菌侵染辣椒后不同時(shí)期的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PcPLD8基因在辣椒疫霉菌侵染辣椒后不同時(shí)期的表達(dá)情況。由圖5可以看出，辣椒疫霉菌侵染辣椒后，PcPLD8基因表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在侵染后48 h和72 h時(shí)顯著升高。

圖5 PcPLD8在辣椒疫霉菌不同侵染時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Expression level of PcPLD8 during the infection stages of P. capsici

2.5 辣椒疫霉菌侵染過程中PcPLD8的功能分析

將重組植物表達(dá)載體pBINGFP2:PcPLD8轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，在本氏煙上進(jìn)行接種，24 h后接種辣椒疫霉游動(dòng)孢子，48 h后紫外燈下觀察。結(jié)果表明，PcPLD8和GFP空載體均能在本氏煙中表達(dá)(圖6B)。相對(duì)于GFP空載體對(duì)照，PcPLD8顯著增強(qiáng)辣椒疫霉菌的侵染(圖6A)，其病斑大小明顯高于對(duì)照(圖6C)。

圖6 辣椒疫霉菌侵染過程中PcPLD8的功能分析Fig. 6 Function analysis of PcPLD8 during the infection stages of P. capsici

3 討論

磷脂酶D催化磷脂在其末端磷酸酯鍵處水解，從而產(chǎn)生磷脂(PA)，兩者一起參與細(xì)胞的多種生理過程，主要包括病細(xì)胞增殖、膜囊泡運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架重排。PLD是一個(gè)高度保守的多基因家族，兩個(gè)HKD保守基序是PLD的活性位點(diǎn)[9]。目前病原卵菌疫霉屬中已發(fā)現(xiàn)6個(gè)亞科的PLD種類，分為PXPH-PLD，PXTM-PLD，TM-PLD，PLD-like以及A和B型sPLD-like[18]，不同類型的磷脂酶D在疫霉菌中可能發(fā)揮著不同的功能。本研究中通過同源比對(duì)在辣椒疫霉菌LT1534基因組中篩選到一個(gè)磷脂酶D基因PcPLD8，并成功克隆得到其全長(zhǎng)cDNA序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PcPLD8不含信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，包含兩個(gè)HKD保守結(jié)構(gòu)域，HKD1為突變的HKR，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)，蛋白序列與致病疫霉PLD-like-1(PITG_00291)相似性為94.54%，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明PcPLD8是典型的PLD-like類磷脂酶D。

文獻(xiàn)研究表明，致病疫霉菌游動(dòng)孢子分化為包囊的過程是由PA和G蛋白共同觸發(fā)，包囊化是病原菌侵染宿主的關(guān)鍵步驟，并發(fā)現(xiàn)PLD與游動(dòng)孢子包囊化有關(guān)[19]。釀酒酵母Spo14/PLD對(duì)其孢子的萌發(fā)至關(guān)重要[10]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PcPLD8在辣椒疫霉菌發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在孢子萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)量達(dá)到最大值，表明該基因可能在孢子萌發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用。在病原菌與植物的互作過程中，病原菌PLD被認(rèn)為是重要的致病因子，參與病原菌侵染力的調(diào)控。諸如sPLD-like和PLD-like類磷脂酶D可能通過破壞宿主的細(xì)胞膜，從而提高致病疫霉菌的定殖能力[12]。本研究發(fā)現(xiàn)PcPLD8在辣椒疫霉侵染辣椒后，其表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在侵染72 h時(shí)顯著升高。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，PcPLD8顯著增強(qiáng)了辣椒疫霉菌對(duì)本氏煙的致病力。上述結(jié)果表明，PcPLD8在辣椒疫霉菌致病過程中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，PcPLD8可能參與調(diào)節(jié)辣椒疫霉菌的孢子萌發(fā)，且PcPLD8的激活與辣椒疫霉菌的致病力密切相關(guān)。這些結(jié)果有助于闡明PLD在辣椒疫霉菌生長(zhǎng)發(fā)育過程和致病過程中的作用機(jī)制，同時(shí)也為植物免疫尋找新的靶標(biāo)基因。