基于網絡藥理學和分子對接探究斑蝥治療肝癌的作用機制

林曉彤 黃重銘 彭慧婷 陳虹宇 王文萍 王思斯 曹 洋

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤中心，廣東廣州 510405

近年來，惡性腫瘤成為影響全球人類健康的疾病之一。我國作為原發性肝癌發病率的高危國家之一，肝癌的死亡率高達23.7%，成為威脅國人健康的公共衛生問題[1-2]。中醫藥治療肝癌具有增效減毒、改善生活質量、延長生存期等優勢。斑蝥為芫菁科昆蟲南方大斑蝥（Mylabris phalerata Pallas）的干燥體，是我國最早發現具有抗腫瘤作用的中藥之一。現代藥理學研究顯示，斑蝥具有抗病毒、抗腫瘤、調節免疫等活性，已廣泛應用于腫瘤臨床治療中[3]。目前斑蝥治療肝癌作用機制尚未明確，本研究通過網絡藥理學分析和分子對接的方法來探討斑蝥治療肝癌的作用機制。

1 資料與方法

1.1 斑蝥成分的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）對“斑蝥”進行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥18%為條件，篩選出斑蝥活性化合物。結合2010 年1 月至2020 年10 月中國知網、萬方、維普數據庫檢索相關文獻，篩選并匯總斑蝥的活性成分。通過SwissTargetPrediction 數據庫對斑蝥活性成分的作用靶點進行預測，設置可能性＞0.1 篩選出潛在的作用靶點。

1.2 肝癌的靶點收集及潛在靶點的預測

以“Liver Cancer”為關鍵詞在GeneCards 數據庫和OMIM 數據庫進行檢索，匯總去重后得到肝癌基因靶點。利用R 軟件將斑蝥的作用靶點與肝癌基因靶點進行映射，獲得斑蝥活性成分-肝癌潛在靶點的維恩圖，得到斑蝥抗腫瘤的潛在靶點。

1.3 關鍵靶點蛋白蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建

將關鍵靶點蛋白輸入String 數據庫，限定物種為“Homosapiens”，導出保存TSV 文件。將TSV 文件導入Cytoscape，并繪制PPI 網絡圖。

1.4 斑蝥-活性成分-肝癌靶點網絡的構建

利用Cytoscape 構建斑蝥-活性成分-肝癌靶點互作網絡。其中，網絡中節點代表著斑蝥、活性成分和關鍵基因靶點；邊線代表著斑蝥與活性成分、活性成分與作用靶點、疾病與靶點的關系。

1.5 斑蝥的GO 分析和KEGG 通路富集分析

Bioconductor 是一個提供基因組數據分析和注釋工具的R 語言軟件包集合平臺。安裝Bioconductor 中的“ClusterProfiler”“DOSE”及“Pathway”軟件包，運行R 先后繪制出斑蝥治療肝癌潛在作用靶點的GO 富集分析氣泡圖與KEGG 通路富集分析柱狀圖。

1.6 分子對接驗證

結合PPI 網絡分析中關鍵靶點蛋白互作程度，選取互作程度最高前2 名靶點蛋白為關鍵靶點蛋白。ZINC 數據庫中搜索斑蝥活性成分mol2 格式結構，利用PDB 數據庫下載關鍵靶點蛋白的PDB 格式的結構。運用AutoDockTools 軟件對靶點蛋白進行去除水分子、加氫等預處理，導入并設置成小分子配體，隨后將靶點蛋白與小分子配體轉換成pdbqt 文件，對其進行分子對接，獲得兩者對接所需的最低結合能。結合能代表活性成分與靶點蛋白結合所需能量，結合能越低，表明活性成分與靶點蛋白的結合力越強[4]。

2 結果

2.1 斑蝥的活性成分及靶點

結合數據庫與文獻查閱對斑蝥活性成分進行篩選，共獲得6 個有效活性成分（表1）；并得到145 個預測作用靶點。

表1 斑蝥有效活性成分信息

2.2 肝癌靶點的獲取與潛在靶點的預測

數據庫檢索匯總去重后得到肝癌靶點1442 個，將145 個斑蝥作用靶點與1442 個肝癌相關基因靶點進行匹配，斑蝥與肝癌的潛在作用靶點44 個。見圖1。

圖1 斑蝥活性成分與肝癌潛在靶點的維恩圖

2.3 PPI 網絡分析

PPI 網絡圖包括44 個節點，233 條邊。節點代表靶點蛋白，節點大小及顏色深淺代表靶點蛋白的degree值，其中degree 值越大則靶點顏色越深、面積越大。節點之間的連線代表著靶點蛋白之間關聯性，連線的顏色越深、越粗意味著靶點蛋白間關聯性越高。PPI 網絡分析顯 示IL-6、MAPK3、MAPK1、ESR1、PTGS2 屬于斑蝥治療肝癌的核心靶點蛋白。見圖2。

圖2 斑蝥的關鍵靶點蛋白互作網絡

2.4 斑蝥-活性成分-肝癌靶點互作網絡分析

斑蝥-活性成分-肝癌的靶點互作網絡圖包含44 個關鍵靶點，97 條邊。見圖3。

圖3 斑蝥-活性成分-肝癌靶點網絡圖

2.5 GO 及KEGG的富集分析

GO 富集氣泡圖顯示斑蝥治療肝癌關鍵靶點的主要生物學功能涉及細胞增殖、體內激素分泌與調控、蛋白質轉運等生物學過程。見圖4（封三）。

圖4 GO 富集分析氣泡圖

KEGG 通路富集分析顯示，斑蝥抗肝癌的關鍵基因靶點富集的通路主要與細胞增殖與凋亡、腫瘤血管新生、炎癥介導及細胞黏附相關。見圖5（封三）。

圖5 KEGG 通路富集分析柱狀圖

2.6 分析對接結果

分子對接顯示，IL-6、MAPK3 與所有活性成分都顯示出良好的結合活性（表2）。其中，3-苯基-4-氮雜芴與IL-6 及MAPK3 對接顯示出最好結合力。見圖6～7。

表2 IL-6、MAPK3 與活性成分的分子對接結果（kJ/mol）

圖6 IL-6 與3-苯基-4-氮雜芴分子對接圖

圖7 MAPK3 與3-苯基-4-氮雜芴分子對接圖

3 討論

油酸、亞油酸、十八碳七烯酸、去甲斑蝥素、3-苯基-4-氮雜芴、斑蝥素等成分可能是斑蝥治療肝癌的物質基礎。研究表明，斑蝥素可通過抑制β-連環蛋白和細胞周期蛋白D1的表達，將細胞周期阻滯在G2/M 期并誘導其凋亡[7]。去甲腎上腺素通過ERK1/2和NF-κB 信號通路的磷酸化下調MMP-9 和u-PA的表達，抑制HCC 細胞的遷移和侵襲能力[8]。

PPI 結果顯示，IL-6、MAPK3、MAPK1、ESR1、PTGS2為互作程度最高的前5 個靶點。IL-6 可引起JAK 磷酸化激活STAT3 形成二聚體，誘導腫瘤新生血管形成，與腫瘤轉移密切相關[9]。MAPK3 與MAPK1 均為MAPK家族成員，其中通過激活下游RAS/RAF/MAPK/ERK通路參與調控細胞的增殖分化的過程；還可以激活JNK 和p38/MAPK 通路在炎癥和細胞凋亡中發揮重要作用[10-11]。PTGS2 其催化合成的前列腺素為肝損傷中重要的炎癥介質，可促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡，增加腫瘤細胞的侵襲能力[12]。ESR1 為雌激素受體，乙型肝炎病毒（HBV）誘發ESR1 高甲基化，從而誘導肝炎的發生甚至進展成為肝癌[13]。中藥斑蝥通過調控上述靶點的表達而發揮抗腫瘤的作用。

KEGG 通路富集顯示，斑蝥抗肝癌的關鍵靶點基因所在的介導的通路可歸納為以下4 類：第1 類與細胞增殖與凋亡相關，如AGE-RAGE 結合可協同誘導MAPK 信號傳通路的活化，加速細胞氧化應激，促進細胞增殖[14-15]；AGEs-ROS 還能通過介導P38、MAPK和JNK 活化，引起促凋亡的caspase-3 級聯反應，誘導細胞凋亡[16-17]；TNF-α 通過內質網應激信號通路誘導腫瘤細胞自噬，促進腫瘤增殖[18-19]。第2 類與血管新生途徑相關，如VEGF 通過刺激腫瘤血管內皮細胞增殖，調節小靜脈血管的滲透性，加速腫瘤細胞的遷移[20-22]；CLEC-2 誘導激活的血小板上調整合素和選擇素表達使癌栓牢固地黏附于血管內皮，釋放炎癥因子進而增加血管的通透性，促進腫瘤細胞的外滲和轉移[23-24]。第3 類與炎癥介導相關，AGE-RAGE 結合促進NF-κB的活化，上調靶基因的轉錄活性，促進炎性細胞因子IL-6的釋放[25-26]。第4 類與細胞黏附相關，如CLEC-2 與配體蛋白結合后，通過激活Ras 家族成員RhoA，促進細胞骨架重組及下調E-鈣黏蛋白的表達水平，加速腫瘤的轉移[27-28]。因此，斑蝥可能通過調控細胞增殖與凋亡、炎癥微環境、血管新生途徑及細胞黏附從而起到治療肝癌的作用，反映了斑蝥多靶點、多通路抗腫瘤的特點。

綜上所述，本研究發現斑蝥是通過多種活性成分，調控多個靶點，作用多條通路去實現促進細胞凋亡、抑制血管新生的抗腫瘤作用，其中AGE-RAGE 通路及C型凝集受體通路可作為未來研究斑蝥抗肝癌機制的方向。