基于網絡藥理學與分子對接探討水陸二仙丹治療糖尿病腎病的潛在分子機制

李亞蒙 侯亞威 徐玉坤 李 芮

1.山東中醫藥大學中醫學院，山東濟南 250000；2.山東中醫藥大學附屬醫院老年醫學科，山東濟南 250000

水陸二仙丹（金櫻子-芡實）出自《洪氏經驗方》，金櫻子生于山上謂之“仙”，味酸甘澀，性平，固精縮尿；芡實生于水中，味甘澀，性亦平，益腎固精；二者用于治療男子遺精白濁，女子帶下及小便頻數、遺尿等癥狀[1]。

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的發病機制尚不完全清楚，但與糖代謝紊亂密切相關，作為最嚴重的微血管并發癥之一，DN 已成為終末期腎病主要發病原因，臨床上多采用葡萄糖控制、脂質調節、抗氧化和血管緊張素轉換酶抑制劑等措施，但效果不理想[2]。因此運用中西醫結合的治療方式被學者普遍認同，在傳統祖國醫學中，DN 屬于“消渴”“水腫”等范疇，中藥能夠明顯延緩DN的進展，減輕患者痛苦。其中水陸二仙丹是治療DN的常用處方，并取得良好成效[3]。

現為明確水陸二仙丹治療DN的具體分子機制，運用網絡藥理學方法，并進行分子對接驗證，明確作用靶點及分子機制，為進一步探索DN的發病機制及開發新的治療藥物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 藥物相關靶點的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫尋找2 味中藥化學組成成分，并進行ADME 篩選，按照口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 兩個閾值初步獲得藥物有效活性成分及其作用的蛋白質靶點，并通過TCMID 及中國知網、萬方搜集2015 年1 月至2020 年9 月的文獻補充未預測到的靶點，刪除未預測到的靶點有效活性成分，將篩選后得到的靶點統一在Uniprot 蛋白質數據庫規范化合物作用靶點[4]。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建

將藥物活性成分及靶點導入Cytoscape 3.7.2 中，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。

1.3 疾病相關靶點的篩選

在GeneCards 數據庫中挖掘DN的潛在靶點，該數據庫Score 值越高則代表該靶點與疾病關系越密切。根據學者經驗，疾病靶點過多，則設為Score≥中位數的目標靶點為DN的潛在靶點，并在TTD 數據庫、OMIM 數據庫及DRUGBANK 中尋找DN 靶點予以補充，刪除4 個數據庫的重復值得到DN 靶點。

1.4 維恩圖及蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

為明確“藥物-疾病”靶點間的相互作用，利用R語言繪制二者維恩圖，獲得交集靶點。將交集靶點導入STRING11.0 版數據庫中進行PPI 分析，獲得PPI網絡，導出tsv 格式文本，并將其文本導入Cytoscape 3.7.2 中，借助MCODE 插件，對PPI 網絡中緊密區域進行提取及可視化[5]。

1.5 藥物-疾病靶點功能與通路富集分析

將“1.4”項下交集靶點導入Metascape 平臺，物種選擇H.Sapiens（70），設置均為默認值，完成其主要的GO 生物學過程及KEGG 信號通路分析，通過生物信息學平臺對數據結果進行可視化分析。

1.6 “成分-靶點-通路”網絡圖的構建

通過Cytoscape 3.7.2 構建“成分-靶點-通路”網絡圖，對交集的網絡進行拓撲分析，包括連接度、介度中心性、緊密度中心性，據此探究水陸二仙丹治療DN發揮作用的主要成分、靶點及通路。

1.7 分子對接驗證

將“1.6”項下主要成分與靶點進行分子對接驗證，依據TCMSP 搜索化合物小分子2D 結構，采用Chem-Draw 19.0 繪出此2D 結構，然后導入到Chem3D 19.0中獲得化合物小分子的3D 結構，并保存為Mol2 格式，導入到Pymol 中，對其進行去水、移除靶蛋白中的配體，該配體及處理過的靶蛋白分別保存為PDB 格式。從RCSBPDB 數據庫中獲取靶蛋白的3D 結構。采用AutoDockTools1.5.6 對化合物小分子及靶蛋白結構轉化為pdbqt 格式，并設置其活性口袋，運行vina 1.1.2進行分子對接，采用PyMol 對結果可視化分析。

2 結果

2.1 藥物靶點的獲取

初步獲得金櫻子化學成分48 種、芡實化學成分26 種，經ADME 篩選后共獲得金櫻子6 種活性成分、芡實1 種活性成分，見表1。金櫻子成分作用靶點158 個、芡實成分作用靶點22 個，合并后刪除重復靶點共得到166 個靶點。

表1 水陸二仙丹主要成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建

“藥物-活性成分-靶點”網絡圖中，共得到176 個節點，272 條邊，菱形代表藥物，正三角代表藥物活性成分，橢圓代表藥物靶點。見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖

2.3 疾病靶點的獲取

在Genecards 數據庫獲得DN 靶點3319 個，該靶點Score 中位數為3.18，故設定Score≥3.18的靶點為DN的潛在靶點。結合TTD、OMIM、DRUGBANK 數據庫補充相關靶點，4 個數據庫靶點結合刪除重復值，得到1261 個靶點。

2.4 維恩圖及PPI 網絡構建

“藥物-疾病”靶點維恩圖中，獲得70 個交集靶點，見圖2。PPI 網絡共有259 條邊，平均節點度值為7.4，PPI 富集P<1.0e-16，導出tsv 格式文件及PPI 網絡圖，見圖3。PPI 網絡較為復雜，通過Cytoscape 3.7.2 MCODE發現PPI 網絡中緊密聯系的基因團模塊有3 個。見圖4。

圖2 “藥物—疾病”靶點維恩圖

圖3 “藥物-疾病靶點”PPI 網絡圖

圖4 PPI 網絡中的緊密分子結構

2.5 GO 與KEGG 通路富集分析

通過Metascape 平臺對交集靶點進行通路信號分析，并通過生物信息學平臺對結果可視化。GOBP 選取前20 個集群、GOCC 選取11 個 集群、DOMF 選取前16 個集群，每個集群選取1 個代表進行分析，GO結果如圖5 所示。水陸二仙丹治療DN的KEGG 通路圖見圖6（封四）。

圖5 “藥物-疾病”交集靶點GO 分析

圖6 “藥物- 疾病"交集靶點KEGG分析

2.6 “成分-靶點-通路”網絡圖構建

“成分-靶點-通路”網絡圖見圖7，倒三角代表藥物成分，方形代表通路，橢圓形代表靶點，該網絡有73 個節點，412 條邊。從圖中可發現AGE-RAGE 信號通路富集最為顯著，槲皮素、葉紅素及山柰酚3 種活性成分與該通路密切相關，則槲皮素、葉紅素為該通路主要活性成分，與該通路相關的靶點有23 個，其中AKT1、MAPK1、VEGFA 和CCND1 是該通路的主要靶點，與DN的發生機制緊密相關。見表2。

表2 成分-通路-靶點

圖7 “成分-靶點-通路”網絡圖

2.7 分子對接結果

將“2.6”項下主要成分與其對應靶點對接結果所示，槲皮素與葉紅素與其對應靶點具有較好的親和力，槲皮素與MAPK1 對接結合能為-8.5 Kcal/mol，穩定性最高，見表3，分子對接模式見圖8。

表3 分子對接結合能

圖8 分子對接模式圖

3 討論

本研究從水陸二仙丹中篩選出7 個活性成分作用靶點。通過“藥物-活性成分-靶點”網絡圖分析，推測槲皮素、葉紅素、山柰酚是藥物的主要活性成分。有研究顯示[6-11]，槲皮素能夠通過降低機體氧化應激水平、增強肝臟丙酮酸激酶活性及抑制胰島細胞凋亡起到降糖作用，槲皮素的抗炎、抗氧化應激及抑制腎臟纖維化對腎臟起到保護作用；葉紅素相關研究較少，但本研究發現葉紅素與多個靶點進行連接，并且與主要靶點有較好的對接活性，提示葉紅素具有較好的降糖保腎的作用，值得進一步研究；山柰酚可減輕高糖下的腎小球內皮細胞氧化應激及凋亡，抗感染，防治動脈硬化。

PPI 網絡中分離出3 個模塊，查閱文獻報道對3 個模塊參加的生物學過程進行分析[12-16]，第一模塊主要參與白細胞趨化性、炎癥反應等過程；第二模塊主要參與脂多糖的反應、脂質的反應等過程；第三模塊主要參與膠原分解、大分子等代謝過程。GO 生物功能分析發現，主要涉及脂多糖的反應，活化氧代謝過程，調控血管生成、細胞凋亡等多個生物學過程。對20 條KEGG 通路分析[17-21]，以AGE-RAGE 通路為主體，可刺激VEGF 增加血管的通透性引起蛋白尿，刺激血管緊張素Ⅱ的產生及在AT1 受體過度表達從而加速DN的惡化；大量文獻顯示表明[22-24]，AGE-RAGE 通路下游機制較為繁雜，作用機制尚未完全明了，值得進一步研討。VEGF 通路可刺激心血管生長因子亞家族，促進腎臟微血管的形成，延緩DN的進展，激活內分泌抵抗，調節脂肪細胞中的脂肪分解及碳水化合物的消化吸收減輕糖尿病癥狀，學者們認為結合能小于-5 Kcal/mol 是分子對接時受體與配體穩定結合的標準，結合能越低分子對接結合穩定性越高[25]，分子對接驗證發現活性成分與對應的靶點有較好的對接活性。

水陸二仙丹通過槲皮素、葉紅素等活性成分，調控AKT1、MAPK1、VEGFA 等相關靶點的表達，進而干預AGE-RAGE、HIF-1、ErbB 多條通路，調控脂多糖的反應、活化氧代謝過程、血管生成等生物功能發揮治療DN的作用。