CHB患兒干擾素α1b長(zhǎng)期給藥后血清β2-微球蛋白濃度的影響因素分析

柴燕濤 王福川 侯 俊 賈 凡 劉 佳 姜棋予 張 敏 畢京峰▲

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部，北京 100039；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部，北京 100039；3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床檢驗(yàn)中心，北京 100039；4.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床輸血科，北京 100039

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是影響我國(guó)人民健康的一個(gè)重大疾病[1]。截至2018 年4 月，我國(guó)慢性乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B，HBV）感染者9300 萬(wàn)人，慢性肝炎患者高達(dá)2000 萬(wàn)人[2-3]，其中1～4歲、5～14歲和15～29歲人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）流行率分別為0.32%、0.94%和4.38%[4]。乙型肝炎E 抗原（hepatitis Be antigens，HBeAg）陽(yáng)性孕婦為7.00%～11.00%，HBeAg陰性孕婦為0%～1.00%[5-6]，新生兒及1歲以下嬰幼兒的HBV 感染慢性化風(fēng)險(xiǎn)為90.00%[7]。干擾素-α（interferon-α，IFN-α）已被我國(guó)批準(zhǔn)用于兒童患者的治療[8]，由于β2 微球蛋白的體內(nèi)濃度-時(shí)間曲線與IFN的體內(nèi)藥-時(shí)曲線有相似的趨勢(shì)，是公認(rèn)的藥效學(xué)指標(biāo)[9-12]。然而，在連續(xù)給藥，尤其兒童患者在長(zhǎng)期給藥后，療程、年齡、性別等因素是否影響β2-微球蛋白的血清濃度尚不明確，客觀上可能影響其能否作為藥效學(xué)指標(biāo)應(yīng)用于兒童長(zhǎng)期給藥藥代/藥效學(xué)聯(lián)合研究的效果。本研究已獲中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心（以下簡(jiǎn)稱“我院”）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年12 月至2019 年9 月于我院就診的108例接受IFN α1b 治療的門診及住院CHB患者的血清樣本，該樣本參考?xì)W洲“2013 ESPGHAN 兒童時(shí)期慢性乙型肝炎的診治指南”[13]，符合CHB 臨床診斷及IFN 治療指征。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1～16歲，男女不限；②基線血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aminotransferase，ALT）為正常值上限2～10 倍；③HBV DNA≥2.00×103IU/ml；④患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他病毒性肝炎或艾滋病；②合并重要系統(tǒng)、器官等的重大疾病；③合并智力異常、癡呆、精神病；④研究醫(yī)生認(rèn)為不適宜參與本研究；⑤接受過(guò)其他抗病毒藥物治療。

1.2 臨床資料的采集與管理

①血液樣本采集：所有樣本均來(lái)自兒童進(jìn)行生化檢測(cè)時(shí)的剩余樣本，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo 公司，Micro 21R）900 g，15 min 分離血清，置-70℃冰箱中保存待測(cè)。②制訂兒童慢性乙型肝炎臨床信息采集表，包括基本信息：聯(lián)系方式、姓名、性別、年齡、民族、身高、體重、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、生活習(xí)慣（吸煙、飲酒）、病史、臨床診斷、病毒基因分型，詳細(xì)記錄血樣采集前給藥時(shí)間、血樣采集時(shí)間、給藥劑量。

1.3 β2-微球蛋白檢測(cè)方法

①樣品準(zhǔn)備：完全融化后，混勻，900 g，10 min 后吸取上清，用樣本稀釋液稀釋5000 倍，使稀釋后的樣本光密度（optical density，OD）值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的OD 值范圍內(nèi)，如果OD 值未在此范圍內(nèi)，再對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。②試劑配制及操作方法：按照試劑盒[Human Beta-2 Microglobulin（B2M）SimpleStep ELISA Kit，貨號(hào)：ab181423]說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品工作液、Antibody Cocktail、洗液的配置，其中標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度由高到低分別為2000.00、1000.00、500.00、250.00、125.00、63.00、31.25 pg/ml。在板中按順序加入50.00 μl稀釋后樣本、標(biāo)準(zhǔn)品工作液（均做2 個(gè)復(fù)孔）后，加入50.00 μl Antibody Cocktail，平板搖床（LE PARD 公司，Leopard V）室溫400 r/min 反應(yīng)1 h，洗板機(jī)（BioTek 公司，ELX50）洗板3 次，最后1 次用紙拍干。再加入100.00 μl TMB Develpoment Solution，平板搖床400 r/min 避光反應(yīng)15 min 后，加入100.00 μl Stop Solution 平板搖床400 r/min 混勻1 min（注意避光），微孔板檢測(cè)儀（BioTek 公司，Synergy H4）450 nm處讀取OD 值。③結(jié)果分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品工作液的濃度及各濃度對(duì)應(yīng)的OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用Origin軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行曲線擬合，所有數(shù)據(jù)r2均＞0.90。將OD 值帶入到曲線擬合的公式中，換算出各個(gè)樣本的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的最終濃度。

1.4 樣本量的確定依據(jù)

本研究擬應(yīng)用多重線性回歸分析相關(guān)影響因素。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，預(yù)計(jì)納入BMI、療程、年齡、給藥時(shí)間、HBV 基因型、給藥劑量、性別等7 個(gè)自變量。考慮到多重線性回歸分析要求樣本量應(yīng)為自變量個(gè)數(shù)的10～20 倍，擬納入至少100例樣本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于Epidata 數(shù)據(jù)庫(kù)。所有統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程均基于SAS 9.4 完成。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。采用Spearman 相關(guān)分析β2 微球蛋白與年齡、療程、給藥時(shí)間及BMI的關(guān)系。多重線性回歸分析β2 微球蛋白的相關(guān)影響因素。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床信息基本情況

本研究共采集了108例患兒的血液樣本，年齡1～16歲，中位年齡為5（4，7）歲；男性患兒64例（59.26%），女性患兒44例（40.74%）；全部為漢族；均無(wú)煙、酒史，均無(wú)其他疾病病史。中位BMI 為15.85（14.85，16.65）kg/m2；中位療程為338（167，715）d；給藥時(shí)間（采樣時(shí)間與采樣前最后1 次用藥的間隔時(shí)間）為1123（842，2349）min；給藥劑量≤40.00 μg 共47例（43.52%），＞40.00 μg 共61例（56.48%）；HBV 基因型中B型有20例（18.52%），C型有81例（75.00%），6例患者基因型缺失，1例為非B 非C型，故未納入分析。

2.2 β2 微球蛋白與年齡、療程、給藥時(shí)間及BMI的相關(guān)性分析

β2 微球蛋白與年齡、療程、給藥時(shí)間及BMI 無(wú)相關(guān)性（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 β2 微球蛋白與年齡、療程、給藥時(shí)間及BMI的相關(guān)性分析

2.3 不同性別、HBV 基因型、給藥劑量β2 微球蛋白的比較

不同性別、HBV 基因型、給藥劑量β2 微球蛋白，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 不同性別、HBV 基因型、給藥劑量β2 微球蛋白的比較

2.4 血清β2 微球蛋白濃度影響因素的多因素分析

將血清β2 微球蛋白濃度作為因變量，性別（女=1，男=2）、給藥劑量（≤40.00 μg=1，＞40.00 μg=2）、HBV基因型（C型=1，B型=2）、年齡、給藥時(shí)間、療程、BMI作為自變量引入模型以α=0.1 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。給藥劑量、年齡、給藥時(shí)間、療程是影響血清β2 微球蛋白濃度的相關(guān)因素（P ＜0.05），其中血清β2 微球蛋白濃度伴隨給藥劑量的升高而升高，伴隨年齡、給藥時(shí)間及療程的增大而降低。見表2。

表2 血清β2 微球蛋白濃度影響因素的多重線性回歸分析

3 討論

β2-微球蛋白是由99 個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，是由淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白[14-16]，是細(xì)胞中完整組織相容性抗原分子的一部分[17]。正常條件下，血中含量極微，生成量較恒定[18-19]，其主要生理作用為參與識(shí)別異己物質(zhì)和提供殺傷細(xì)胞受體的作用[18]。由于分子量小，且不與血漿蛋白結(jié)合，故可自由通過(guò)腎小球，但原尿中的β2-微球蛋白約99.90%在近端腎小管被重吸收并降解，僅有微量約0.10%隨尿液排出體外[20]，因此，β2-微球蛋白常作為腎損傷的標(biāo)志物用于臨床腎損傷檢測(cè)[21-23]。

近年來(lái)，β2-微球蛋白常作為INF的藥效學(xué)標(biāo)志物[12,24]用于INF的藥代/藥效學(xué)研究，通常被解釋為INF 結(jié)合β2-微球蛋白表面受體后觸發(fā)的復(fù)雜細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的結(jié)果，刺激了患者體內(nèi)抗病毒蛋白的合成[24-25]。多項(xiàng)研究顯示，在單次給藥后，β2 微球蛋白的體內(nèi)濃度-時(shí)間曲線與INF的體內(nèi)藥-時(shí)曲線有相似的趨勢(shì)[12,21]，但缺乏連續(xù)給藥后，β2-微球蛋白影響因素的相關(guān)證據(jù)，客觀上可能影響其能否作為藥效學(xué)指標(biāo)應(yīng)用于長(zhǎng)期給藥的藥代/藥效聯(lián)合研究的效果。

本研究基于108例1～16歲應(yīng)用IFN α1b 治療的CHB患兒，發(fā)現(xiàn)給藥劑量、年齡、給藥時(shí)間、療程對(duì)血清β2-微球蛋白濃度均有顯著的影響。其中，伴隨給藥劑量的升高，血清β2 微球蛋白濃度呈升高趨勢(shì)，而伴隨年齡、給藥時(shí)間及療程的增大，血清β2 微球蛋白濃度呈降低趨勢(shì)。本研究提示，血清β2-微球蛋白的濃度不僅僅與給藥劑量有關(guān)，給藥時(shí)間、療程及年齡也對(duì)血清β2 微球蛋白濃度具有一定的影響。

該研究存在的主要問(wèn)題是，受倫理學(xué)的影響，只能應(yīng)用住院兒童患者早上抽取的生化檢測(cè)的剩余樣本進(jìn)行分析，導(dǎo)致多數(shù)患者的給藥時(shí)間，即采樣時(shí)間與采樣前最后一次用藥的間隔時(shí)間較長(zhǎng)，一般大于12 h，屬于間斷數(shù)據(jù)，在“給藥時(shí)間”這一指標(biāo)的分析中可能存在一定的誤差，寄希望于在未來(lái)的研究中進(jìn)一步證實(shí)。