快大型黃羽肉雞肉品質性狀的遺傳參數估計和關鍵基因挖掘

楊欣婷，鄭麥青，譚曉冬，趙桂蘋，黃 超，李 森，李 韋，文 杰，劉冉冉*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養學國家重點實驗室 農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193；2.廣西金陵農牧集團有限公司，南寧 530049)

隨著人民生活質量的提高，消費者對肉品質更加關注。雞胸肉作為飲食中優質蛋白的重要來源，深受人們喜愛。影響肉品質的主要因素包括遺傳基因、營養水平、飼養管理方式和宰前應激。雞肉品質性狀的評價指標包括pH、肉色、系水力、嫩度、肌內脂肪含量、風味物質等。pH作為評價肉品質最重要的指標之一，反映了宰后肌肉糖酵解速率和程度。宰后動物自身的平衡機制被打破，ATP消耗仍在繼續，為維持細胞穩態，機體通過糖酵解合成ATP。ATP水解產生H+，導致宰后肌肉pH下降。宰后pH下降的速度和程度顯著影響肌肉的系水力[1]，當pH降到蛋白質的等電點時，肌原纖維蛋白結合水的能力降低，同時靜電斥力減小，肌原纖維粗絲與細絲的間距變小，分布在其中的水分流失，肉在烹調過程中失重[2]。肉色作為評價肉品質又一重要的指標，直接影響消費者購買意愿[3]。肉色常用感官評定或色差計測定，如CIE系統中L*值表示亮度(lightness)，a*值表示紅度(redness)，b*值表示黃度(yellowness)。肉色主要取決于肌紅蛋白(myoglobin, Mb)的氧化或還原程度[4](約占70%～80%)，剛屠宰后鮮肉的肌紅蛋白尚未與氧結合，處于還原狀態(Mb)，肉呈現暗紅色；與空氣中的氧接觸后，成為氧合肌紅蛋白(MbO2)，肉呈現鮮紅色；隨著時間的延長，亞鐵血紅素中的Fe2+氧化成Fe3+，成為高鐵肌紅蛋白(MetMb)，肉呈現暗褐色[5]。肉色還取決于血紅蛋白(haemoglobin, Hb)(約占20%～30%)和微量有色代謝物的組成，如β-胡蘿卜素的沉積主要影響肉色b*值[6]。此外，肉色也受到肌肉pH的影響[7]，肌肉pH的下降使肌原纖維粗絲與細絲間的水分流失，大量水存在于胞外空間，形成更開放的結構，光的散射增加[8]，肉色更蒼白(肉色L*值升高)。肉雞胸肌的肉色L*值介于45到67之間[9]。在實際生產中，pH終值和肉色L*值作為評判生理正常和異常肉質的重要指標，pH終值<5.7且宰后24 h肉色L*值>53的雞肉，被判定為“類PSE肉”[10]。

目前鑒定到肉品質性狀的主效基因有氟烷基因(halothane gene,Hal)、酸肉基因(rendement napole gene,RN)、磷酸化酶激酶調節亞基α1(phosphorylase kinase regulatory subunit alpha 1,PHKG1)和β-胡蘿卜素加氧酶1(beta-carotene oxygenase 1,BCO1)等。氟烷基因是由蘭尼定受體l基因(skeletal muscle ryanodine receptor,RYR1)的點突變(1843C-T)導致蛋白受體第615位上的Arg突變為Cys造成的[11]。在應激因子作用下，肌漿內鈣離子非正常釋放，造成肌肉持續收縮，屠宰后肌肉糖降解加速，進而產生PSE肉[12]。酸肉基因由AMP-激活蛋白激酶γ3亞基(protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 3,PRKAG3)的突變密碼子(R200Q)引起，突變使AMPK活性降低3倍[13]，肌肉中糖原含量提高70%以上[14]，導致pH終值過低，引起酸肉效應。PRKAG3的多態性位點和氨基酸替換對肉質都有不同程度的影響，顯性錯義突變(R225Q)會導致肌肉糖原含量顯著增加[15]，氨基酸替換T30N和G52S與宰后24 h肉色L*值顯著相關[16]，而氨基酸替換I199V則會使骨骼肌中糖原含量降低,有利于改善肉質[17]。PHKG1的Intron9剪接受體位點的點突變(8283C-A)導致開放閱讀框中的32 bp缺失，終止密碼子過早產生，降低PHKG1的mRNA和蛋白表達水平，降低糖原磷酸化酶激酶(phosphorylase kinase,PHK)的酶活性，造成豬肌肉組織中糖原分解速率下降，肌糖原貯積過高和pH終值過低。BCO1啟動子的2個SNPs降低了啟動子活性和mRNA表達量，增加雞血漿和胸肌中的葉黃素和玉米黃質含量，雞胸肌肉色b*值升高[18]。敲除BCO1基因的小鼠器官中也會出現β-胡蘿卜素的積累[19]。肉色較淺的魚也會比肉色較紅的魚具有更高的BCO1表達和蛋白豐度[6]。

除此之外，pH和肉色等相關肉品質性狀定位到的QTL有：雞1號染色體上396 cM的QTL影響雞胸肌初始pH[20]，區域內4個差異表達基因(KLHL15、APOO、PRDX4、ACOT9)都受到調節以保護肌肉細胞免受氧化應激來控制pH，從而影響系水力、滴水損失和肉的加工產量[21]。Bihan-Duval等[22]在6代pH終值上、下選系的肉雞中共定位到24個QTLs與胸肌pH終值相關，10個QTLs與腿肌pH終值相關。Sun等[23]定位到COL1A2基因上游的SNP與雞胸肌肉色L*值顯著關聯，并且COL1A2基因在肉色L*值高低組中差異表達。COL1A2基因在中國眉山豬的紅肌和白肌之間也存在表達差異(4倍)[24]。

本研究以快大型黃羽肉雞終端父系為研究素材，基于“京芯一號”55K SNP芯片基因分型，對胸肌肉品質性狀進行遺傳參數估計和GWAS分析，以期獲得影響黃羽肉雞肉色和pH性狀的基因及顯著位點，為肉品質性狀遺傳選擇方案制定和主效基因/SNP鑒定奠定必要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗群體為廣西金陵農牧集團有限公司生產飼養的快大型黃羽肉雞終端父系，來自2個世代共1 923只 雞，其中公雞1 013只，母雞910只。每個世代的雞同一天孵化，采用階梯式籠養方式，進行常規免疫，自由采食和飲水，飼料參照NRC(1994)國際標準，所有個體健康狀況良好。

1.2 性狀測定

56日齡(上市日齡)統一屠宰，并進行屠宰性狀、胸肌肉品質性狀的測定。屠宰性狀包括全凈膛重(g)、胸肌重(兩側)(g)、胸肌率(%)，測定和計算方法參照中華人民共和國農業行業標準《肉雞生產性能測定技術規范》(NY/T 828-2004)。肉品質性狀包括宰后24 h pH、宰后15 min肉色、宰后24 h肉色，屠宰后剝離同一側胸肌，使用HI8424便攜式pH計(哈納 HANNA，意大利)測定pH，使用CR-410色彩色差計(柯尼卡美能達公司，日本)測定肉色，測定方法參照中華人民共和國農業行業標準《肉的食用品質客觀評價方法》(NY/T 2793-2015)。所有表型值，以“平均值±3倍標準差”進行質量控制。

1.3 基因分型與質控

雞翅靜脈采血后，將血液均勻涂在血液采集卡的點樣圈內，然后自然陰涼至完全干燥后，常溫送至實驗室以磁珠法抽提血液DNA。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用NanoDrop 2000進行質量評估。合格的基因組DNA利用“京芯一號”雞55K SNP芯片[25]檢測基因型。

使用PLINK(V1.9)軟件[26]對SNP進行質量控制，具體過程為：個體基因型檢出率≥ 90%，單個SNP檢出率≥ 90%，最小等位基因頻率≥ 95%，哈代-溫伯格平衡檢驗P≥ 1×10-6，共有1 923只雞和43 662個SNPs通過質控，用于后續研究。

1.4 遺傳參數估計

使用R(V3.6.0)軟件ASReml v3.0程序[27]的限制性極大似然法(REML)擬合線性混合模型，估計屠宰性狀和肉品質性狀的方差組分。使用Wald F檢驗固定效應，顯示性別和世代對所有屠宰性狀和肉品質性狀的效應均顯著(P<0.05)。運用單性狀分析法，估算各性狀的遺傳力，基于系譜的BLUP方法的單性狀動物模型：

Y=Xb+Zu+e

基于基因型數據的GBLUP方法的單性狀動物模型：

Y=Xb+Zu+e

運用兩性狀分析法估算各性狀間的遺傳相關和表型相關，基于系譜的BLUP方法的兩性狀動物模型：

其中，y、b、u、e同BLUP方法的單性狀動物模型。

基于基因型數據的GBLUP方法的兩性狀動物模型：

其中，y、b、u、e同GBLUP方法的單性狀動物模型。

1.5 全基因組關聯分析

使用GEMMA(V0.98.1)軟件[28]構建單性狀混合線性模型進行GWAS分析。SNP 作為固定因子，個體親緣關系作為隨機效應。統計模型如下:

y=Wα+xβ+u+ε,u～MVNn(0,λτ-1K),ε～MVNn(0,τ-1In)

其中，y是表型值的向量；W是固定效應矩陣，包括性別和世代；α是包含截距在內的相應系數；x是基因型向量；β是SNP的效應向量；u是隨機效應；ε是殘差。λ是2個方差組分的比率，τ-1是殘差的方差，K是SNP估計的中心親緣關系矩陣；ε是殘差向量，In是單位矩陣。

利用Wald檢驗法確定SNP的顯著性。利用Bonferroni校正多重檢驗確定顯著性閾值,全基因組顯著水平閾值為1.15×10-6(0.05/43 662),全基因組水平潛在顯著閾值為2.29×10-5(1/43 662)。使用R(V3.6.0)軟件qqman包，實現GWAS結果的可視化。

SNP 解釋性狀遺傳變異的計算公式：

1.6 連鎖不平衡分析

使用Haploview軟件[29]的“Solid spine of LD”算法對顯著SNPs進行連鎖不平衡分析，構建單倍型區塊。

1.7 基因注釋

使用Ensembl、UCSC、Genecards數據庫，查詢顯著SNPs所在位置的候選基因，進行基因功能注釋。

2 結 果

2.1 性狀描述性統計

本研究對1 923只黃羽肉雞的屠宰性狀和胸肌肉品質性狀進行表型測定，包括全凈膛重、胸肌重、胸肌率、宰后15 min肉色L*值(L*15 min)、宰后15 min肉色a*值(a*15 min)、宰后15 min肉色b*值(b*15 min)、宰后24 h肉色L*值(L*24 h)、宰后24 h肉色a*值(a*24 h)、宰后24 h肉色b*值(b*24 h)、宰后24 h pH(pH24 h)。描述性統計分析結果見表1。其中，全凈膛重、胸肌重、a*15 min、b*15 min、a*24 h、b*24 h的變異系數較高，介于13.78%到20.98%，具有較大的遺傳改良潛力。

表1 屠宰性狀和胸肌肉品質性狀的描述性統計

2.2 遺傳參數估計

基于BLUP方法估計的屠宰性狀和胸肌肉品質性狀的遺傳參數見表2，基于GBLUP方法估計的屠宰性狀和胸肌肉品質性狀的遺傳參數見表3。基于BLUP方法估計L*15 min、胸肌率的遺傳力分別為0.47、0.50，屬于高遺傳力；b*15 min、L*24 h、b*24 h、pH24 h、胸肌重的遺傳力分別為0.21、0.38、0.34、0.38、0.40，屬于中等遺傳力；a*15 min、a*24 h的遺傳力分別為0.10、0.17，屬于低遺傳力。基于GBLUP方法估計L*15 min、L*24 h、b*24 h、pH24 h、胸肌重、胸肌率的遺傳力分別為0.25、0.29、0.32、0.29、0.31、0.40，屬于中等遺傳力；b*15 min、a*24 h的遺傳力分別為0.19、0.17，屬于低遺傳力。兩種方法除了a*24 h的遺傳力估計值一致外，BLUP方法估計的遺傳力均要大于GBLUP方法估計的遺傳力。表型相關方面，兩種方法的估計值較一致，L*15 min與L*24 h、b*15 min與b*24 h、胸肌重與胸肌率為較高的正相關(0.52～0.70)，L*24 h與a*24 h、L*24 h與pH24 h為較高的負相關(-0.39～-0.48)。遺傳相關方面，兩種方法的估計值較一致，L*15 min與L*24 h、a*15 min與a*24 h、b*15 min與b*24 h、胸肌重與胸肌率為較高的正相關(0.63～0.99)，L*24 h與a*24 h、L*24 h與pH24 h、L*15 min與胸肌率為較高的負相關(-0.47～-0.76)。

表2 基于BLUP方法估計的屠宰和胸肌肉品質性狀的遺傳力(對角線)、表型相關性(對角線以下)、遺傳相關性(對角線以上)及其標準誤

表3 基于GBLUP方法估計的屠宰和胸肌肉品質性狀的遺傳力(對角線)、表型相關性(對角線以下)、遺傳相關性(對角線以上)及其標準誤

2.3 全基因組關聯分析

L*15 min、L*24 h、b*24 h和pH24 h的顯著SNPs信息見表4，全基因組關聯分析的曼哈頓圖和Q-Q圖見圖1。對于L*15 min，1個SNP(rs15291911)達到全基因組水平潛在顯著閾值，位于3號染色體上，在NSL1基因內部。對于L*24 h，9個SNPs達到全基因組水平潛在顯著閾值，位于5號染色體上,構成1個 575.63 kb的顯著區間(Chr5: 48.49-49.06 Mb)，其中3個顯著SNPs(rs16506880、rs14545229、rs14545237)位于EVL基因內部，3個顯著SNPs分別位于SLC25A47(rs14545421)、WARS(rs317845442)、BEGAIN(rs312473490)基因內部，1個顯著SNPs(rs312331816)位于DLK1基因下游895 bp處。對于b*24 h，7個SNPs達到全基因組水平潛在顯著閾值，2個顯著SNPs位于5號染色體上，其中rs14528290位于ZFYVE26基因內部，rs312473490位于BEGAIN基因內部；5個顯著SNPs位于11號染色體上，其中rs313386167和rs312270923位于CDYL2基因內部，rs14966310和rs15621925位于BCO1基因內部。對于pH24 h，1個 SNP(rs313754724)達到全基因組水平潛在顯著閾值，位于28號染色體上，在ARHGEF18基因內部。

X軸的1～28表示1～28號染色體，29代表Z染色體；圖中粗實線代表全基因組水平潛在顯著閾值(2.29×10-5),細實線代表全基因組顯著水平的閾值(1.15×10-6)

表4 胸肌肉品質性狀的顯著關聯SNPs信息

2.4 連鎖不平衡分析

L*24 h顯著區間(Chr5: 48.49～49.07 Mb)和b*24 h顯著區間(Chr11: 15.51～15.69 Mb)上的顯著SNPs的連鎖不平衡分析結果見圖2。方格中的數字為D’，表示連鎖不平衡的程度；方格顏色越深，表明SNPs之間的連鎖不平衡程度越強。單倍型區塊由軟件自動生成，1個單倍型區塊內的SNP完全連鎖。L*24 h顯著區間(Chr5: 48.49～49.07 Mb)上存在2個單倍型區塊，大小分別為24 和427 kb；b*24 h顯著區間(Chr11: 15.51～15.69 Mb)上存在2個單倍型區塊，大小分別為57 和2 kb。

A.位于5號染色體上的2個單倍型區塊；B.位于11號染色體上的2個單倍型區塊

2.5 單倍型的效應分析

表5 單倍型對胸肌肉品質性狀的影響

3 討 論

3.1 遺傳參數估計

本研究中，BLUP和GBLUP方法估計的表型相關較一致，L*15 min與L*24 h、b*15 min與b*24 h、胸肌重與胸肌率為較高的正相關(0.52～0.70)，L*24 h與a*24 h、L*24 h與pH24 h為較高的負相關(-0.39～-0.48)。BLUP方法和GBLUP方法估計的遺傳相關較一致，L*15 min與L*24 h、a*15 min與a*24 h、b*15 min與b*24 h、胸肌重與胸肌率為較高的正相關(0.63至0.99)，L*24 h與a*24 h、L*24 h與pH24 h、L*15 min與胸肌率為較高的負相關(-0.47～-0.76)。先前研究中，6495只肉雞的L*24 h與a*24 h(-0.57)、pH24 h與L*24 h(-0.79)、pH24 h與b*24 h(-0.33)、b*24 h與a*24 h(-0.23)均為負表型相關，L*24 h與b*24 h(0.48)、pH24 h與a*24 h(0.52)均為正表型相關[35]；1 022只 肉雞的L*24 h與a*24 h(-0.28)、pH24 h與L*24 h(-0.83)、pH24 h與b*24 h(-0.53)均為負遺傳相關；L*24 h與b*24 h(0.51)、pH24 h與a*24 h(0.15)均為正遺傳相關[33]。以上研究與本研究估計的表型相關和遺傳相關結果較一致。

3.2 全基因組關聯分析

目前已有研究通過GWAS定位到影響pH和肉色等肉品質性狀的候選基因。1 768頭“三元雜”豬的pH終值定位到候選基因GLUL[36]。165頭杜洛克母豬的初始pH和pH終值定位到候選基因PKHD1L1、VCPIP1和LOC102166532[37]。150頭蘇太豬的背最長肌和半膜肌pH和肉色定位到候選基因BNIP3、PRKG1和ADRB3[38]。劉大鵬等[39]結合轉錄組測序，定位到555只北京鴨×野鴨F2代資源群體的胸肌肉色b*值的候選基因SELENOT。

在本研究中，L*15 min定位到候選基因NSL1，該基因編碼的蛋白質具有兩個位于著絲粒上的卷曲螺旋域，在細胞分裂期間與微管連接，并調節染色體運動(https://www.genecards.org/)。L*24 h定位到的候選基因有BEGAIN、DLK1、EVL、SLC25A47、WARS。BEGAIN編碼的蛋白質維持突觸后密度的結構，與突觸的蛋白質-蛋白質相互作用和化學突觸間的傳遞相關。DLK1編碼肌肉發育的促進因子[40]和脂肪發育的抑制因子[41]，是體內成肌細胞正常分化和肌肉再生必需的[42]，并在雞脂肪和肌肉發育中起作用[43]。EVL編碼肌動蛋白相關蛋白，增強肌動蛋白成核和聚合，參與一系列依賴于細胞骨架重塑和細胞極性的過程[44]。WARS基因上的His-257-Arg突變會降低細胞活力，抑制神經突生長，導致肢體肌肉無力和萎縮的運動神經病[45]。值得一提的是，SLC25A47屬于溶質載體家族成員，該家族有眾多基因均影響pH和肉色等肉品質性狀。SLC24A5在歐洲和南亞人群的淺膚色中發揮作用[46]；SLC2A1在6代pH終值上、下選系的肉雞中差異表達[22]；SLC3A2是豬肉滴水損失的候選基因[47]；SLC37A4的突變會導致某些器官和組織的糖原貯積病[48]。b*24 h定位到的候選基因有BCO1、BEGAIN、CDYL2和ZFYVE26。其中，ZFYVE26突變會導致遺傳痙攣性截癱，表現為肌萎縮、軸突神經病、陣攣[49]。BCO1是雞胸肉色b*值的主效基因，在動物體內類胡蘿卜素的代謝過程中發揮重要作用，對雞胸肉色[18]、家禽皮膚顏色[50]、魚肉色[6]、牛肉脂肪顏色[51]、人類黃皮病[52]均有影響。pH24 h定位到候選基因ARHGEF18，該基因編碼調節多種細胞功能的GTP結合蛋白，誘導肌動蛋白應力纖維的形成。20日齡雞血液pH同樣定位到ARHGEF18，該基因可能是影響雞胸肉色pH24 h的重要候選基因[53]。

3.3 單倍型的效應分析

單倍型效應分析顯示，5號染色體上Block1為CCCCGG型的個體具有更低的L*15 min、L*24 h、b*24 h和更高的pH24 h，5號染色體上Block2為CCGGAAAATTCC型的個體具有更低的L*24 h、b*24 h和更高的pH24 h，說明這2個單倍型對雞的pH和肉色性狀具有一因多效作用，并且是雞肉品質性狀的有利單倍型，可以嘗試在實際育種中加以選擇利用。

4 結 論

本試驗對快大型黃羽肉雞的肉品質性狀進行了遺傳參數估計和全基因組關聯分析，胸肌pH、肉色L*值和b*值為中等遺傳力性狀(0.21～0.38)，適合進行遺傳改良；pH和肉色性狀的全基因組關聯分析，共篩選到18個達到全基因組水平潛在顯著閾值的SNPs和5個達到全基因組顯著水平的SNPs，分別位于3、5(Chr5: 48.49～49.06 Mb)、11(Chr11: 15.51～15.69 Mb)和28號染色體上，候選基因包括ARHGEF18、BCO1、BEGAIN、CDYL2、DLK1、EVL、NSL1、SLC25A47、WARS、ZFYVE26。其中，BCO1是已鑒定的雞胸肌肉色b*值的主效基因；SLC25A47屬于溶質載體家族成員，影響L*24 h，該家族有眾多基因均影響pH和肉色等肉品質性狀。此外，位于5號染色體上的2個單倍型對胸肌pH、肉色性狀均有極顯著影響。這些結果為黃羽肉雞肉品質性狀的遺傳改良和分子機制的深入研究奠定了重要基礎。