柴胡多糖通過抑制氧化應激和炎癥反應減輕鉛誘導小鼠肝腎損傷的研究

謝志明，吳春梅，陳少元，王 照，王 巖

(1.白城師范學院生命科學學院，白城 137000；2.白城市洮北區農民科技教育中心，白城 137000；3.中國人民解放軍32397部隊醫院神經內科，白城 137000；4.吉林省地方病第一防治研究所，白城 137000；5.白城市傳染病醫院，白城 137000)

鉛是一種廣泛存在于自然界中的有毒重金屬，通常在環境中以有機(四乙基鉛)和無機(醋酸鉛、氯化鉛和硝酸鉛)等形式存在，其廣泛使用造成嚴重的環境污染和健康問題，對肝、腎、腦等器官均有損害作用[1]。許多研究表明，鉛暴露能促進活性氧自由基(ROS)的產生，使機體處于氧化應激狀態，破壞機體氧化/抗氧化動態平衡，改變抗氧化酶活性及脂質過氧化水平，從而導致細胞氧化損傷[2,3]，此外，ROS的過量產生可能會誘導細胞凋亡和炎癥性疾病[4]。柴胡為傘形科多年生草本植物，是我國傳統的中草藥，包括北柴胡和小葉黑柴胡，具有抗炎及調節免疫作用。胡柴主要含有柴胡皂苷、甾醇、揮發油、脂肪油和多糖等物質[5]，其中多糖結構是柴胡生物活性的基礎，其為柴胡的主要活性成分之一[6]，具有疏散解熱、抗炎、免疫調節、保肝、抗病毒等多種功效[7-8]，因此柴胡多糖的功能研究對疾病的治療具有重要意義。

近年來，利用天然植物提取物來改善由于重金屬暴露而對機體造成的各種生理損傷，是藥理學和毒理學一個新興的研究領域。研究發現，具有抗氧化潛力的植物提取物可以減輕因重金屬暴露引起的機體損傷[9]。而目前關于柴胡多糖對鉛中毒的研究甚少，因此本研究以染鉛小鼠為模型，旨在探討天然植物提取物柴胡多糖通過抑制氧化應激和炎癥反應減輕鉛誘導小鼠肝腎損傷的作用，以期為柴胡多糖的開發利用和鉛中毒的緩減提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品柴胡(小葉黑柴胡根部)購于寶芝林農業科技有限公司，產地甘肅定西，用組織粉碎機粉碎，參考楊立明等[10]方法制備柴胡多糖(沸水浴浸提法，提取3次)，冰乙酸去蛋白、乙醇沉淀制得粗多糖，經Sephadex G-75純化得到純多糖，淡棕色透明液體，經測定，其中糖含量為94.5%，酸水解后經氣相色譜測定該多糖由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖組成。

1.2 試驗方法

試驗選取150只體重(18±2)g SPF級6～8周齡雄性健康昆明小鼠，購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心，進行2周適應性飼養，根據先前的研究，當醋酸鉛添加劑量為5%時，小鼠表現出明顯的中毒癥狀[11]。試驗開始時，小鼠每天飲鉛水(醋酸鉛0.5%，溶于去離子水)，設置對照組飲去離子水，連續4周，其中在第4周結束時，先測定小鼠肝、腎組織中鉛蓄積含量，肝組織中ALT和AST活性及肝腎組織中MPO活性，驗證建模是否成功。

建模結束后，將小鼠分成5組：對照組，鉛處理組，柴胡多糖和鉛聯合處理Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組3次重復。聯合處理I組、II組及Ⅲ組每隔1 d灌胃柴胡多糖1次，灌胃劑量分別為100、200、400 mg·kg-1，連續2周，正常組和模型組小鼠灌胃給予等容量的蒸餾水。試驗期間，動物室溫度為(22±2)℃，相對濕度為(55±10)%，光/暗循環為12 h，環境保持清潔，在不銹鋼籠子里飼養，嚴格控制鉛污染，飲水進食用具為玻璃器皿使用前用酸浸泡，再用雙蒸水清洗，各組間飼養管理無差異性。

1.3 樣品采集

每天觀察動物外觀、體征、行為活動等，每周記錄體重2次。各處理組在試驗結束時，末次禁食不禁水24 h，小鼠摘眼球取血0.5 mL，肝素鈉抗凝，斷頸處死小鼠，打開腹腔，分離完整的肝和腎組織(分為兩部分)，用于鉛含量測定和抗氧化指標測定，將腎用生理鹽水洗凈2～3次，用濾紙吸干水稱重，全血、左腎和部分肝4 ℃保存，右腎及剩余組織于-80 ℃ 冰箱冷凍保存。

1.4 指標測定及方法

1.4.1 小鼠血液及組織中鉛的測定 按照Moniuszko-Jakoniuk等[12]的方法測定鉛含量。取1.0 mL全血、腎、肝，分別加混合酸進行濕法消化，用0.5 mol·L-1HNO3溶解殘渣，定容，采用全自動石墨爐原子吸收分光光度法測定鉛的含量。

1.4.2 小鼠組織抗氧化能力的測定 取小鼠肝、腎組織，按試劑盒要求制備組織勻漿，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)、丙二醛(MDA)指標的測定均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，按照試劑盒說明進行操作。

1.4.3 小鼠血清及肝組織中丙氨酸轉移酶(ALT)和谷草轉移酶(AST)的活力測定 采用南京建成 ALT、AST 測定試劑盒(賴氏法)取小鼠血清和肝進行測定。血清樣品直接取樣進行測定，肝組織樣品制備成10%的肝組織勻漿后，離心取上清液待測。

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1.4.4 小鼠血清血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量的測定 給藥結束后，腹主動脈取血，離心分離血清，低溫保存備用，采用全自動生化分析儀檢測血BUN、Scr水平。

1.4.5 小鼠肝腎組織中炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)含量及髓過氧化物酶(MPO)活性的測定 按照酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書操作，測定小鼠肝腎組織中炎癥因子TNF-α、IL-6含量，MPO活性測定具體參考楊珊等[13]方法。

1.4.6 實時熒光定量PCR檢測基因表達 采用Trizol法從小鼠肝和腎中提取總RNA，根據試劑盒提供的指導說明，對總RNA進行反轉錄，以進行qRT-PCR分析，并使用cDNA樣品進行qRT-PCR。引物的設計合成：以β-actin為內參基因，運用 Primer Premier 5.0設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，引物設計如表1，通過qRT-PCR測定基因表達水平，用對照組平均值歸一法與2-ΔΔCt法進行計算相對mRNA表達水平。

表1 引物序列信息

1.5 數據分析

2 結 果

2.1 鉛誘導小鼠模型的建立

由圖1所示，通過前期試驗可知，鉛處理組小鼠肝、腎組織中鉛含量明顯高于對照組(P>0.05)，鉛處理組均可使小鼠肝組織中ALT和AST活性顯著升高(P<0.05)，使小鼠肝、腎組織中MPO活性明顯升高(P<0.05)，且在試驗期間，小鼠活動無異常，綜上所述，說明小鼠模型建立成功。

圖1 鉛誘導對小鼠肝、腎組織指標的影響

2.2 柴胡多糖對鉛誘導小鼠體重的影響

由表2所示，各組小鼠體重增長對照組最快，鉛處理組最慢，其中低、中、高劑量柴胡多糖與鉛聯合處理組均高于鉛處理組，但差異不顯著(P>0.05)；鉛處理組小鼠肝體比、腎體比增大，而柴胡多糖與鉛聯合處理后均使其下降，基本接近于對照組，但均差異不顯著(P>0.05)。

表2 柴胡多糖對鉛誘導小鼠體重及肝、腎系數的影響

2.3 柴胡多糖對鉛誘導小鼠全血及組織中鉛含量的影響

由表3所示，鉛處理組小鼠全血、肝和腎組織中鉛含量差異均高于對照組，具有統計學意義(P<0.05)，說明鉛誘導小鼠模型達到良好效果。與鉛染毒組小鼠相比，低、中、高劑量柴胡多糖與鉛聯合處理組小鼠全血鉛、肝鉛和腎鉛含量均有所降低，但鉛的含量變化差異均不顯著(P>0.05)。

表3 柴胡多糖對鉛誘導小鼠血液及肝、腎組織中鉛含量的影響

2.4 柴胡多糖對鉛誘導小鼠組織抗氧化能力的影響

由圖2所示，鉛處理組SOD、GSH-Px及CAT活性顯著降低與對照組相比(P<0.05)，添加低、中、高劑量柴胡多糖組的SOD、GSH-Px及CAT活性逐漸升高，而鉛處理組MDA含量高于對照組，添加柴胡多糖后MDA含量逐漸減低。其中高劑量組SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量與對照組基本保持一致，無顯著性差異(P>0.05)。

C.對照組；T.鉛處理組；Ⅰ.聯合處理Ⅰ組；Ⅱ.聯合處理Ⅱ組; Ⅲ.聯合處理Ⅲ組。數據表示為不同上標的值表示有顯著性差異(P<0.05)，下同

2.5 柴胡多糖對鉛誘導小鼠血清和肝組織ALT和AST水平的影響

血清和肝組織中的ALT和AST水平反映了小鼠肝功能的變化。如圖3所示，與對照組相比，鉛處理組均引起血清和肝組織中ALT和AST活性顯著升高(P<0.05)。采用低、中、高劑量的柴胡多糖灌胃后，血清和肝組織勻漿ALT和AST活力的增加顯著減弱，其中高劑量柴胡多糖組與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 柴胡多糖對鉛誘導小鼠血清和肝ALT和AST活力的影響

2.6 柴胡多糖對鉛誘導小鼠血清BUN、Scr含量的影響

如圖4所示，與對照組相比，鉛處理組小鼠血清BUN、ScrNF-κB、IL-1β和TNF-α明顯升高(P<0.05)。與鉛處理組相比，低、中、高劑量柴胡多糖組小鼠血清Scr、BUN含量顯著降低，且柴胡多糖各組呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖4 柴胡多糖對鉛誘導小鼠血清BUN、Scr含量的影響

2.7 柴胡多糖對鉛誘導小鼠肝、腎組織中TNF-α、IL-6含量、MPO活性及炎癥反應相關因子mRNA相對表達量的影響

如圖5所示，與對照組相比，鉛處理組顯著提高了小鼠肝、腎中TNF-α、IL-6含量及MPO的活性，而低、中、高劑量柴胡多糖組灌胃小鼠后，TNF-α、IL-6、MPO活性均下降，與鉛處理組相比，中、高劑量處理組效果顯著(P<0.05)，其中低劑量組基本與鉛處理組相接近。

圖5 柴胡多糖對鉛誘導小鼠肝、腎組織中TNF-α、IL-6含量及MPO活性的影響

如圖6所示，與對照組相比，鉛處理組小鼠肝、腎組織中NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA表達量明顯升高(P<0.05)。與鉛處理組相比，柴胡多糖低、中、高劑量組均可顯著降低NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA表達水平(P<0.05)，其中柴胡多糖高劑量組中NF-κB和IL-1β mRNA表達量與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，而柴胡多糖高劑量組的效果優于柴胡多糖低、中劑量組。

圖6 柴胡多糖對小鼠肝、腎中NF-κB、IL-1β和TNF-α基因表達的影響

2.8 柴胡多糖對鉛誘導小鼠肝、腎氧化損傷相關因子mRNA相對表達量的影響

如圖7所示，與對照組相比，鉛處理組小鼠肝、腎組織中Keap1 mRNA水平顯著升高，Nrf2、HO-1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CATmRNA水平顯著降低(P<0.05)，而給小鼠灌胃低、中、高劑量柴胡多糖時，Nrf2、HO-1、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CATmRNA水平得到了改善，逐漸上升，其中高劑量組效果最顯著(P<0.05)，與鉛處理組相比，Keap1 mRNA水平顯著降低，高劑量組與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 柴胡多糖對鉛誘導小鼠肝、腎組織中Nrf2、Keap1、HO-1、CAT、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表達的影響

3 討 論

長期接觸重金屬與肝、腎及肺等臟器疾病的發病率增加有關，對生殖系統、神經系統和免疫系統等多種系統功能具有一定的破壞作用。其中鉛作為一種毒性重金屬[14]，鉛暴露可能會損害免疫反應，氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等都與鉛引起的肝、腎毒性有關，研究表明，鉛暴露能夠增加炎癥和氧化應激水平，并誘導肝腎功能紊亂，最終將導致明顯的肝腎功能損害[11]。本試驗結果表明，柴胡多糖可抑制鉛中毒小鼠體重的下降和臟器系數的升高與對照組相比，添加柴胡多糖使小鼠血液及組織中鉛濃度略有降低。夏道宗等[3]采用低、中、高劑量的杭白菊總黃酮可拮抗鉛中毒小鼠體重的下降和臟器系數的升高，使杭白菊總黃酮對小鼠血液及組織中排鉛效果顯著，且未造成鋅的流失；周東月等[15]研究發現，與模型組比較，黃連多糖組大鼠體重顯著增加，而腎系數明顯減小；劉芳麗等[16]研究表明，鉛誘導使小鼠肝、腎的臟器系數增大，給予小鼠灌胃白藜蘆醇后均可使其下降，部分接近于正常水平，同時小鼠全血鉛、肝鉛和腎鉛含量均有所降低，這與本研究結果基本保持一致。

氧化應激在鉛毒性機制中發揮了重要作用，鉛能使細胞活性氧增加，破壞機體抗氧化防御體系，改變抗氧化酶活性及脂質過氧化水平，從而導致細胞氧化損傷[17]。其中SOD、CAT、GSH-Px和MDA是評價機體氧化應激水平的主要指標，SOD具有清除自由基、對抗和阻斷活性氧對細胞造成的傷害并及時修復受損細胞的功能[18]；CAT可以迅速除去細胞的毒性代謝產物，從而對機體起到保護作用；GSH-Px具有維持細胞結構和功能完整性的作用，其主要通過促進過氧化氫的分解、降低過氧化氫水平而實現[19]；DMA為脂質氧化物的最終產物，能夠間接反應組織細胞的損傷程度[20]。本研究結果表明，鉛中毒導致小鼠肝腎組織SOD、GSH-Px及CAT活性明顯降低(P<0.05)，而MDA含量高于對照組，給予柴胡多糖后使得小鼠肝腎組織SOD、GSH-Px及CAT活性顯著提高，MDA含量降低，與鉛處理組相比，差異均顯著(P<0.05)，說明鉛中毒可引起小鼠過氧化損傷，柴胡多糖可以減輕鉛中毒引起的氧化應激，提高小鼠機體的抗氧化能力。當MDA含量急劇升高時，小鼠體內的氧化/抗氧化平衡受到破壞，脂質過氧化加??；而SOD、GSH-Px及CAT活性下降，說明鉛在小鼠體內持續積累，使小鼠出現鉛中毒，抑制了體內抗氧化酶的活性。常東等[11]發現南瓜多糖使小鼠血清和肝組織SOD活性、GSH-Px活力上升，MDA含量降低，與中毒模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)；植物提取物杭白菊總黃酮可顯著抑制鉛中毒小鼠腦、肝和腎脂質過氧化，使其抗氧化酶的活性提高[3]，均與本試驗研究結果相符。

肝ALT和AST通常被用作肝細胞損傷的間接生化指標，是肝功能損害最重要的標志[21]。在本研究中，血清和肝組織中ALT和AST活性的顯著增加，表明鉛暴露導致了明顯的肝損傷，同時采用低、中、高劑量的柴胡多糖顯著降低了ALT和AST水平(P<0.05)，進一步表明柴胡多糖發揮對鉛誘導小鼠肝腎組織損傷的調節效應。肝功能測試表明，重金屬誘導導致血清中肝酶(ALT、ASP和ALP)的活性顯著升高，表明由于肝細胞的細胞膜可能受損而導致過度滲漏，這些生物標志物的血清水平被顯著用作嚴重肝損害的指標。研究發現，富含槲皮素的小葉植物乙醇葉提取物可以改善鉛、汞重金屬誘導的大鼠氧化還原失衡[22]；劉思思[23]研究發現，與鉛處理組相比，低、高濃度葡萄籽原花青素可以顯著降低鉛處理組血液的ALT、AST活性；姜婧等[24]研究發現，與對照組相比，鉛誘導大鼠醋酸鉛組血清中ALT和AST活性顯著升高，而醋酸鉛+原花青素組可使血清中ALT和AST的活性顯著降低(P<0.05)，這均與本研究結果基本一致。測定血清中BUN含量可以判斷腎小球的濾過功能。本研究表明柴胡多糖可使鉛誘導小鼠血清Scr、BUN顯著降低，且柴胡多糖低、中、高劑量組呈劑量依賴性(P<0.05)。謝晶等[25]研究表明，黃連多糖可顯著降低糖尿病大鼠BUN、Scr水平及24 h尿蛋白(P<0.05)，說明黃連多糖具有減輕糖尿病大鼠腎損傷的作用，該作用與抑制氧化應激及炎癥反應有關；有證據表明，與模型組相比蒲公英根葉提取物各劑量組大鼠腎組織病理損傷減輕，血清Scr、BUN、TNF-α及IL-6水平等均降低，且蒲公英根葉提取物各組之間呈劑量依賴性(P<0.05)，說明蒲公英根葉提取物可抑制炎癥反應和氧化應激[15]。綜上所述，與本研究結果基本相似。

MPO是一種具有強抗菌特性的限制酶，存在于骨髓來源的細胞如中性粒細胞的細胞質中，是組織炎癥的可靠標記物[26]。在本研究中發現鉛暴露使小鼠肝、腎組織MPO活性增強，而添加柴胡多糖能夠顯著降低由鉛誘導引起的小鼠肝、腎組織MPO活性的明顯增強，從而發揮柴胡多糖的抗炎作用。已有研究證實IL-6和TNF-α均為炎癥反應的重要介質，在肝、腎損傷過程中，炎癥細胞被激活，炎癥因子被釋放(TNF-α、IL-1β和IL-6)，最終導致中性粒細胞在肝中的積累導致細胞因子表達增加[27]。TNF-α主要是單核細胞與T細胞產生，通過分泌效應作用于其他巨噬細胞，能激活炎癥因子并參與細胞增殖、分化與凋亡過程[28]。IL-6可以通過體液免疫和細胞免疫功能介導宿主防御、炎癥反應和組織損傷修復等多種生物學過程[29]。因此，降低炎癥反應水平，有助于減輕重金屬引起的肝腎損傷。本研究證實，柴胡多糖可以通過降低鉛誘導小鼠肝、腎組織TNF-α、IL-6含量，從而抑制炎癥遞質，對緩減小鼠肝、腎損傷具有一定功效，其作用機制可能與其抗氧化作用有關。研究發現，柴胡多糖濃度為40、80 μg·mL-1時，顯著降低了LPS誘導的巨噬細胞分泌促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-12p40水平，說明柴胡多糖可提高某些促炎細胞因子的產生，結合柴胡多糖具有促進吞噬細菌的作用，說明在非炎癥條件下柴胡多糖能夠增強機體的免疫功能[8]，這一結果與本文結論相類似。TNF-α可用作測試物質毒性的生物標志物，當機體暴露于重金屬的環境污染物時，活化的NF-κB可促進促炎因子的基因轉錄和蛋白合成，從而引起炎性細胞因子如IL-1β、IL-6和IL-8的高表達，加速對細胞的毒性作用，最終導致器官功能障礙[20，30-31]。本研究發現，與對照組相比，染鉛組小鼠肝、腎組織NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA表達顯著增加，從而解釋了鉛介導炎癥反應并最終導致肝腎組織損傷，而通過低、中、高劑量的柴胡多糖可不同程度的降低NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA水平，從而說明柴胡多糖可有效緩減炎癥反應，使其小鼠肝、腎組織得到保護。

SOD主要包括Cu/Zn-SOD和Mn-SOD兩種酶，其基因表達量變化有助于判斷機體內氧化應激與抗氧能力狀態[32]。本研究結果顯示，鉛處理組小鼠SOD含量降低，Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及CAT的表達降低，因此，證明了鉛可能通過干擾酶活性和增加氧化產物而誘導氧化應激，鉛中毒降低肝的抗氧化功能可能是通過影響Keap1/Nrf2/HO-1途徑的表達來實現的[33]，而低、中、高劑量柴胡多糖處理組對小鼠肝、腎組織的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及CAT水平與鉛處理組相反，表明柴胡多糖可增加鉛中毒小鼠的清除氧自由基能力。柴胡多糖可以通過抑制氧化應激，調控機體自由基的代謝，從而實現對鉛中毒小鼠的腎臟保護作用。已有研究證明抗氧化反應是通過Nrf2途徑調節的，通常Nrf2通過Keap1依賴性泛素化和蛋白酶體降解保持較低水平，當發生氧化應激時，Nrf2可能會從Keap1定向降解中釋放出來，從而導致Nrf2轉運到細胞核中，并通過激活ARE依賴的基因表達，增加大量抗氧化和細胞保護蛋白(如HO-1)的含量[34-35]。在本研究中發現，當小鼠攝入有毒鉛時，顯著提高了小鼠肝腎組織中Keap1 mRNA水平，降低了Nrf2和HO-1 mRNA水平，但給鉛中毒小鼠灌胃柴胡多糖使其表達水平基本恢復正常，這表明鉛暴露會干擾Nrf2通路，抗氧化能力將受到抑制，然而柴胡多糖可有效抑制了鉛的肝、腎組織毒性，導致Nrf2通路的激活，此外，鉛通過改變炎性因子的基因表達引起肝、腎損傷，而柴胡多糖通過激活Keap1/Nrf2/HO-1途徑并降低炎癥程度來預防肝、腎損傷。鉛暴露誘導小鼠肝腎組織中Nrf2信號通路的mRNA降低，而柴胡多糖可顯著提高Nrf2信號通路的mRNA水平表達，抑制鉛誘導的肝、腎損傷，進而減輕鉛誘導肝、腎組織的免疫功能紊亂[8]。

4 結 論

低、中、高劑量柴胡多糖均對鉛誘導小鼠的肝、腎損傷均具有一定的調節效應，其中柴胡多糖高劑量組對小鼠的組織損傷保護作用最顯著，進而說明柴胡多糖可減輕鉛誘導小鼠肝、腎損傷作用，提高小鼠機體抗氧化能力，緩減了鉛誘導小鼠氧化應激及炎癥反應。