四川地區藏豬戊型肝炎病毒的檢測和遺傳演化分析

曹 慧，楊丹嬌，張 敏，李 平，張朝輝，湯 承,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.國家民族事務委員會青藏高原動物疫病防控創新團隊，成都 610041；3.四川省甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所，康定 626000；4.四川省甘孜藏族自治州動物疫病預防控制中心，康定 626000)

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E Virus，HEV)引起的一種人和多種動物患病的人獸共患病，一般經糞口途徑傳播。人HE在發展中國家和地區發病率達80%以上，致死率為1%左右，懷孕期為6～8月的孕婦死亡率可達20%[1]。目前在我國HE仍以散發形式流行[2]。過去認為HE流行地區主要分布在發展中國家[3-4]，但是近年來在美國、法國、新西蘭、澳大利亞等發達國家亦有散發病例報道[5-6]。人們在豬、羊、老鼠等動物中相繼檢測到戊肝病毒[7-9]。

HEV是一種正鏈單股RNA病毒，屬于肝炎病毒科正嗜肝病毒屬[10]。編碼區由3個部分重疊的開放式閱讀框(ORF1、ORF2 和ORF3)組成。由于該病毒能感染多種動物宿主，跨物種感染很常見，因此HEV的基因組表現出顯著的多樣性。基于這種序列多樣性，被分為至少8種基因型(1-8)[11-13]。1型和2型HEV僅感染人類，在發展中國家，由于飲用污染的飲用水而呈地方性流行[14-15]，基因型3和4主要感染人和各種動物，5型和6型主要感野豬，新發現的7型流行病學分布還不明確，而8型是2016年在我國雙峰駱駝中發現的另一種新的基因型[11]；這些類型的HEV可通過人畜共患病傳播，在世界范圍內引起感染[16]。在我國，基因4型HEV(HEV-4)是主要流行基因型，參與人畜共患傳播[17]，目前已在人和動物中鑒定出9種HEV-4的亞型(HEV-4a至HEV-4i)[18]。豬戊型肝炎可感染人及豬、黑猩猩等多種動物，豬作為僅能感染G3和G4的感染模型，通常表現為隱性，可引起人的高病死率，為一種重要的人獸共患傳染病，因此推測豬源HEV可能是引起人感染戊型肝炎的重要源頭，所以對其流行及傳播進行監測具有重要意義。

藏豬是我國唯一生活在青藏高原東南部重要的地方特色豬種，生活在海拔3 000 m以上的高山或河谷地區[19]，具有適應高海拔惡劣氣候環境和抗病等特點。藏豬養殖以放牧為主，養殖環境衛生條件較差，能與人以及其他動物緊密接觸，共用水源或食物，這種養殖模式有利于HEV的流行，也有利于其跨宿主傳播。為了調查四川地區藏豬戊型肝炎病毒的流行情況和遺傳演化，本研究對2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個藏豬場332份藏豬糞便樣本進行HEV檢測，并對其進行基因分型后，從每年的毒株中挑出1株典型株進行全基因組擴增以及遺傳進化分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

KOD OneTMPCR Master Mix Blue和Quick Taq HS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒和DL2000 DNA Marker購自TaKaRa生物技術有限公司；凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；TGL-16冷凍離心機購自四川蜀科儀器有限公司；PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 病料的采集與處理

病料為2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個藏豬場332份藏豬糞便樣本，其中健康樣本105份，腹瀉樣本227份，樣本于-80 ℃保存。按1∶5加入PBS震蕩混勻，反復凍融3次后，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液凍存于-80 ℃備用。

1.3 引物的設計與合成

參考文獻[20]報道HEV的通用檢測引物為套式PCR引物，擴增產物大小為644 bp，參考文獻[21]發表的HEV全基因擴增的引物序列(表1)對3份陽性毒株進行全基因組的擴增，引物由北京擎科新業生物有限公司合成。

表1 HEV全基因擴增引物信息

1.4 核酸的提取及反轉錄

用Trizol法抽提樣本中總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書制備cDNA。反應體系：總RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo(dT)0.5 μL，反轉錄酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反轉錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。將反轉錄獲得的cDNA放置-20 ℃保存備用。

1.5 藏豬腹瀉樣本中HEV陽性率的調查

以步驟1.3中合成的HEV檢測引物對cDNA樣本進行PCR檢測，PCR反應體系：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.6 HEV陽性樣本基因分型

用DNAStar等分子生物學軟件，將陽性樣本擴增出的ORF2片段進行拼接，將拼接結果分別與GenBank不同血清型HEV毒株的ORF2進行序列比對，借助線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進化樹，分析其遺傳進化關系，最終確定所有陽性樣本的基因型。

1.7 HEV分歧時間估算

以貝葉斯進化分析軟件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序設置序列的采樣時間、氨基酸置換模型、分子鐘模型、馬爾科夫鏈長和先驗參數。以BEAST程序運算，通過MCMC方法進行樹的重復抽樣，獲得具有最大后驗概率的進化樹。通過TreeAnnotator程序設置Burnin值。以FigTree v1.4.4軟件對進化樹進行修飾和分歧時間的標定，分析病毒序列的演化過程。

1.8 HEV全基因組序列的擴增

用RT-PCR法對3株典型HEV毒株陽性樣本全基因進行分段擴增，KOD OneTMPCR Master Mix Blue 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：98 ℃ 10 s、62.4 ℃/63.1 ℃/59.4 ℃/61.7 ℃/65 ℃/53.7 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循環35次。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。根據凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化，按照pMDT19-T Vector Cloning Kit說明書進行連接，并轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆送北京擎科新業生物有限公司進行測序。

1.9 HEV重組分析

為了分析不同來源的HEV毒株之間的遺傳關系和重組關系，以RDP4軟件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法對3株擴增全基因組毒株進行重組分析，利用SimPlot程序對每個簇分別進行相似性分析，對重組區和非重組區構建獨立的進化樹以驗證重組。

2 結 果

2.1 藏豬HEV的檢出率

利用HEV檢測引物[20]，以RT-PCR方法對22個規模化豬場的332份糞便樣本進行檢測。結果顯示：在糞便樣本中，HEV核酸陽性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)；22個規模藏豬場中，HEV豬場陽性率為77.27%(17/22,95%CI=54.6%～92.2%)，健康樣本陽性率為2.86%(3/105，95%CI=0.6%～8.1%))，腹瀉樣本陽性率為28.63%(65/227，95%CI=22.8%～35.0%)，結果表明,HEV在四川藏豬中存在且流行。68個陽性樣本中，65份陽性來自腹瀉樣本，3份來自健康樣本，表明HEV可能與腹瀉有關，有待進一步研究。

2.2 藏豬HEV陽性樣本ORF2片段分析及分歧時間計算

通過MEGA對本研究中的68條測序藏豬源HEV序列與23條分型參考序列進行ORF2片段比對，并通過線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進化樹(圖1)。結果顯示，68個序列彼此之間核苷酸序列相似性為69.6%～100.0%，與之前報道的1～4型HEV分離株核苷酸序列相似性為75.1%～90.2%，與4型HEV的相似性最高(82.5%～90.2%)。根據目前的亞型分型標準，系統進化分析顯示,68株陽性樣本均為G4型，其中4a型HEV毒株在四川地區藏豬HEV傳播中占有明顯優勢。

.4a型；.4b型；●.4 d型；★.4j型；◆.G4型

為進一步研究HEV的進化過程，通過BEAST v1.8.0軟件對87條(其中包括本研究中分別從22個 豬場各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時間的HEV ORF2部分片段進行分歧時間的估算。采用貝葉斯馬爾可夫鏈-蒙特卡羅(MCMC)算法進行分析，通過BEAUti輸出模型的拓撲結構、分支長度和核苷酸替換模型等參數進行重復抽樣，得到貝葉斯進化樹(圖2)。結果表明,D7-2018分歧時間最早為1999年，K10-2018分歧時間為2008年，其余20支毒株均晚于2010年之后產生分歧，可以觀察到17株病毒的分歧時間除D7-2018外，均晚于世界各地HEV毒株的分歧時間，說明四川藏豬HEV可能是由其他地區豬群傳染的。

橫坐標為時間刻度，結點處示病毒分化的時間點。●為本研究毒株

2.3 3株HEV全基因擴增和序列分析

為獲得藏豬HEV分離株進化關系更精確的信息，從3年采集的所有樣本中，每年挑選1株典型毒株共3株進行全基因的擴增，并成功獲得了3株毒株的全基因序列。將全基因序列命名并上傳至GenBank，分別命名為SWU/31-12/2018、SWU/301/2019和SWU/A/2020。SWU/31-12/2018序列長度為7 208 bp，GC含量為55.15%，登錄號為MK410046；SWU/30/2019序列長度為7 244 bp，GC含量為54.13%，登錄號為MW365405；SWU/A/2020序列長度為7 215 bp，GC含量為54.12%，登錄號為MW365406，3株全基因的相似性為89.5%～93.1%。68株陽性樣本均將ORF2序列測序結果提交至GenBank，登錄號為MK410054～MK410091、MW365407～MW365436。將本研究中3條全基因與GenBank數據庫中其他26條HEV全基因序列構建全基因進化樹(圖3)，結果表明，3株HEV均屬于G4型，且與人的HEV毒株親緣關系最近。

●.本研究擴增的3條HEV全基因序列

2.4 HEV重組分析

通過RDP4和SimPlot軟件對3條HEV序列全基因組進行重組分析，結果顯示,SWU/301/2019的多聚蛋白ORF1片段(圖4A)存在重組，選取重組序列SWU/301/2019、親本序列SWU/B6/2018和次要親本SWU/31-12/2018，利用SimPlot軟件進行相似性分析(圖4B)。以斷點位置為界，將SWU/301/2019序列劃分為重組區域(3 746—4 655 bp)和兩個非重組區域(1—3 745 bp，4 656—3′末端)。通過MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法對SWU/301/2019三個區域的核苷酸序列(圖4C1、C2、C3)分別構建進化樹，基于重組區域構建的進化樹與非重組區域顯示出不一致的遺傳系統發育關系，進一步支持了SWU/301/2019的重組事件。

A.RDP4重組分析結果；B.SimPlot相似性分析結果；C1、C3.SWU/301/2019非重組區域構建進化樹；C2.SWU/301/2019重組區域構建進化樹

3 討 論

HEV引起的戊型肝炎是一種自限性疾病，作為人獸共患疾病之一，已在世界范圍內造成了嚴重的公共衛生問題[17-18]。在高原地區，所有動物均以散養為主，且與人類生活區域無嚴格的界限，共用水源與食物，使HEV的流行和傳播加劇，同時也更有利于其跨種間傳播[22-23]。盡管已有研究表明HEV是高原一種重要的地方性疾病，但對于其流行率的分析有限，分子水平的遺傳進化分析較少[24]。

本研究藏豬糞便中HEV陽性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)，意大利一項研究表明，豬腹瀉樣本中HEV陽性率顯著高于健康樣本陽性率[26]，與本研究68份陽性糞便中腹瀉樣本HEV陽性率顯著高于健康樣本相契合，表明HEV的流行可能與腹瀉有關。本研究藏豬HEV陽性率為20.48%，顯著高于2018年對四川豬HEV陽性率進行的報道[27]，同時也顯著高于藏豬血清[24]以及膽汁[25]中HEV感染率的調查，說明在高原地區藏豬感染HEV的情況相當普遍，且以糞便傳播為主，提示人們要重視高原藏豬HEV的防控及流行情況。

HEV最早被認為只感染人類，引起自限性肝炎，免疫功能低下個體可能發生慢性HEV感染[29],隨后被證實為人畜共患疾病[10]，HEV-4型為主要的人畜共患基因型，近年來，也有研究證明HEV-4型為我國主要流行基因型，但4型亞型的流行在不同地方也有明顯差異，如我國南部人和豬以HEV-4b亞型為主，而我國東部以HEV-4a亞型為主[30]，本研究中來自四川藏豬的68株HEV均為4型，且主要為4a型，與該研究結果不一致，可能是由于地域差異。已有研究表明人HEV-4毒株的基因組序列與從同一地理區域獲得的豬HEV-4毒株的基因組序列密切相關[15,31]，而從22個豬場采集的樣本結果顯示主要為4a型，說明該基因型主要由其他地區傳給藏豬，該病原已在當地藏豬群中形成流行。為進一步分析其遺傳演化，本研究通過BEAST v1.8.0軟件對87條(其中包括本研究中分別從22個豬場各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時間的HEV ORF2部分片段進行分歧時間的估算結果分析顯示，四川藏豬的HEV4型毒株進化晚于世界各地毒株，說明藏豬HEV可能是由其他地區豬傳染的，這種現象的形成可能是由于藏豬之間的交配導致豬群之間發生交叉感染。

HEV的重組事件鮮有報道，但HEV-4a的重組事件卻經常出現，并且在病毒進化中發揮了重要作用，已有研究證明人和豬HEV毒株之間可能發生重組，存在雙重組事件，在HEV的ORF2區域內可能發生重組事件[32],另一項研究也表明，病毒在編碼非結構和結構蛋白的基因組連接處重組，創建新的病毒家族，導致人畜共患新型病原的產生(HEV、星狀病毒)[33]。本研究共獲得了3株HEV全基因組，在四川藏豬中鑒定出1株重組HEV-4a毒株：SWU/301/2019。SWU/301/2019重組發生在ORF1區域內，說明HEV ORF1區域也有可能發生重組，產生新的毒株。該重組事件發生在藏豬和人HEV毒株之間，表明藏豬和人之間傳播HEV的潛在風險。

本研究不僅表明了四川藏豬源HEV是由其他地區豬傳染給四川地區藏豬，同時還表明了藏豬源的HEV毒株在不斷進化，毒力有逐漸增強傾向。感染人和動物的HEV 4型毒株為當地主要流行毒株具有潛在的暴發風險，因此應重視HEV的流行，加強對四川藏豬HEV的監測。

4 結 論

本研究對采自四川甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個豬場332份藏豬糞便樣本進行HEV檢測；并對全部樣本進行了ORF2分型以及3份典型陽性樣本進行了全基因組序列擴增分析；通過重組分析發現SWU/301/2019和SWU/31-12/2018有重組現象；遺傳進化分析發現藏豬HEV可能是由其他地區感染豬群傳染的。