番鴨產(chǎn)蛋各期肝脂肪酸組成及AMPK信號通路基因表達(dá)研究

朱文俊，陳興勇,2*,劉 樂，劉政權(quán)，趙羽彤，耿照玉,2

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點實驗室，合肥 230036)

番鴨為優(yōu)良瘦肉型鴨，具有肉質(zhì)好、蛋白質(zhì)含量高、耐粗飼、生長快和體型大等特點。因其產(chǎn)蛋量低，且在個體間存在顯著差異，所以，番鴨產(chǎn)蛋等繁殖性狀成為了當(dāng)前研究的焦點[1-3]。研究普遍認(rèn)為，禽類產(chǎn)蛋主要受體內(nèi)激素水平的影響，肝在雌激素刺激下合成大量脂質(zhì)物質(zhì)釋放入血液中[4-6]。番鴨肝非靶向代謝組學(xué)研究表明，產(chǎn)蛋期差異代謝物主要由脂類和有機(jī)酸類代謝物組成[3]。Li等[7]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示雞產(chǎn)蛋前后肝轉(zhuǎn)錄組譜差異，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集于膽固醇合成、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路和不飽和脂肪酸合成等脂質(zhì)代謝通路?？梢?，產(chǎn)蛋性狀是家禽生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，受到脂肪沉積調(diào)控[8]。

脂肪酸在肝中通過肝細(xì)胞從血漿吸收和從頭生物合成而積累，與甘油組裝成甘油三酯[9]。甘油三酯為脂肪酸在細(xì)胞和血漿中儲存和運輸?shù)闹饕问?，在極低密度脂蛋白(VLDL)形成早期和末期與其結(jié)合[9]，形成富含甘油三酯的VLDL，并分泌至血液，以脂滴形式儲存于腹部脂肪、皮下脂肪、頸部脂肪和腸系膜脂肪[10]。不同于哺乳動物，禽類約90%脂質(zhì)于肝中合成。肝作為家禽機(jī)體重要代謝器官，在脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運和代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-13]。在產(chǎn)蛋期，肝合成蛋黃靶向型VLDL(VLDLy)通過血液轉(zhuǎn)運至卵巢組織并沉積于卵黃中，促進(jìn)各等級卵泡生長發(fā)育[4]。家禽肝在產(chǎn)蛋期間體積增大以合成大量卵黃脂質(zhì)，來滿足產(chǎn)蛋期間卵黃脂質(zhì)沉積需求，肝顏色因脂質(zhì)積累也逐漸變?yōu)辄S色[14]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為脂質(zhì)合成代謝主開關(guān)，在膽固醇合成、脂肪酸氧化、脂肪酸合成和VLDL合成等脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用?；罨疉MPK可導(dǎo)致乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、HMG-CoA還原酶(HMGR)和脂肪酸合成酶(FSH)磷酸化，從而抑制肝中脂肪酸和膽固醇的生物合成[15-16]。因此，探究肝脂肪酸組成及AMPK信號通路對解釋肝在產(chǎn)蛋各期脂質(zhì)代謝具有重要意義。

本研究旨在了解番鴨產(chǎn)蛋各期血脂水平、肝組織學(xué)結(jié)構(gòu)、肝AMPK信號通路基因表達(dá)和其脂肪酸組成，為番鴨肝脂質(zhì)代謝應(yīng)答產(chǎn)蛋提供機(jī)理研究。同時，為產(chǎn)蛋期番鴨合理的飼糧營養(yǎng)水平監(jiān)控、合理的脂肪貯存與營養(yǎng)調(diào)控提供借鑒，以期提高番鴨產(chǎn)蛋量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣品采集

白羽母番鴨飼養(yǎng)于安徽安慶永強(qiáng)農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司，22周齡種鴨光照時間為11 h·d-1，采食量為103 g·d-1；30、40和60周齡種鴨光照時間為17 h·d-1，采食量為160 g·d-1，各飼養(yǎng)階段營養(yǎng)水平均按國家研究委員會(NRC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[17]。分別于產(chǎn)蛋前期(22周齡，(2 152±73)g)、產(chǎn)蛋初期(30周齡，(2 735±92)g)、產(chǎn)蛋中期(40周齡，(2 760±94)g)和產(chǎn)蛋末期(60周齡，(3 100±105)g)隨機(jī)選取健康母番鴨各15羽，禁食12 h后翅靜脈采血并分離血清。屠宰后，收集肝右葉樣本于脂肪固定液中保存?？焖偈占斡胰~樣本于液氮中保存，后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血脂指標(biāo)濃度測定

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂指標(biāo)濃度由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司測定。極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)濃度測定參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行(H249，南京建成生物工程研究所)。

1.3 肝HE和油紅O染色

肝標(biāo)本固定后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、染色等處理。切片制作由武漢賽維爾生物科技有限公司(中國武漢)完成。使用光學(xué)顯微鏡(IX73, Olympus, Japan)觀察切片。ImageJ(V1.58，USA)用于測定切片中脂滴所占比例。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

肝組織總RNA提取參照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行(10606ES60，上海翊圣生物科技有限公司)。瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000(Thermo Fisher公司，USA)用于檢測提取總RNA的完整性和濃度。cDNA合成試劑盒(11123ES60，上海翊圣生物科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄2 μg RNA為cDNA后，-80 ℃保存，直至qRT-PCR分析。

1.5 實時定量PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)GenBank中綠頭鴨LKB1、AMPKα1、HMGR、ACC1、SREBP1c、HNF4α、CPT1、FAS和內(nèi)參β-actin序列設(shè)計熒光定量PCR引物。引物序列及目的片段長度見表1。引物序列由通用生物公司合成。熒光定量采用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(11202ES08，上海翊圣生物科技有限公司)在ABI-7500儀器(Thermo Fisher公司，USA)進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：5 μL Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix，上游和下游引物各0.2 μL，0.6 μL cDNA，4 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，重復(fù)40個循環(huán)。熔解曲線階段按照儀器默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行。采用2-△△CT法計算mRNA相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.6 肝脂肪酸測定

脂肪酸測定參照國標(biāo)GB5009.168—2016[18]方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取1.5 g肝組織轉(zhuǎn)移至10 mL離心管。加入0.66 mL C11∶0內(nèi)標(biāo)(1 mg·mL-1)、0.66 mL 95%乙醇和1.33 mL純水，于全自動樣品快速研磨儀中60 Hz研磨2 min。轉(zhuǎn)移混合物至含有33 mg焦性沒食子酸、33 mg沸石和3.3 mL鹽酸(8.3 mol·L-1)燒瓶中。75 ℃水浴孵育40 min后，加入3 mL 95%乙醇、10 mL乙醚和石油醚混合物(V∶V = 1∶1)。振搖5 min后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置5 min，收集醚層提取液。重復(fù)上述步驟3次，將提取液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘留物即為脂肪提取物。加入1.6 mL 2% NaOH-甲醇溶液，80 ℃水浴孵化3 min。加入1.4 mL 15%的三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)80 ℃水浴孵化3 min。待燒瓶冷卻至室溫后，加入正庚烷2 mL，振搖5 min，再加入3 mL 飽和氯化鈉水溶液，靜置5 min。吸取上層正庚烷提取液1.5 mL至含有0.6 g無水硫酸鈉的離心管中，振搖1 min并靜置5 min后，吸取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾器過濾后至進(jìn)樣瓶中待測定。

脂肪酸甲酯分離參照陳興勇等[19]的方法進(jìn)行，并做適當(dāng)修改。樣品由安捷倫7890A氣相色譜儀(安捷倫技術(shù)公司，USA)分析。色譜柱為DEGS毛細(xì)管柱(DB-WAX, 30 m×0.25 mm×0.25 mm)。柱溫箱參數(shù)設(shè)置如下：初始柱溫為60 ℃，保持2 min后，以15 ℃·min-1升高至200 ℃，然后以3 ℃·min-1升高至230 ℃，保持19 min。載氣為高純氮氣，流速為0.8 mL·min-1。進(jìn)樣口和檢測器溫度為240 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL，分流比為10∶1。使用37種 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(CDAA-252795，上海安譜實驗科技有限公司)定性脂肪酸。使用C11為內(nèi)標(biāo)，通過公式計算各脂肪酸含量，計算公式參照國標(biāo)GB5009.168—2016進(jìn)行[18]。同時計算SFA、MUFA、PUFA和UFA含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計與分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，若無特殊說明，樣品均為15個重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 番鴨產(chǎn)蛋各期血脂水平分析

番鴨產(chǎn)蛋各期血脂水平如圖1所示，TC和LDL-C水平在40周齡顯著高于22、30和60周齡(P<0.05)；TG和VLDL-C水平在各產(chǎn)蛋期變化規(guī)律相似，在30和40周齡顯著高于22和60周齡(P<0.05)，并在40周齡均達(dá)到最大值；30和40周齡番鴨HDL-C水平顯著低于22和60周齡(P<0.05)。

柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 番鴨產(chǎn)蛋各期肝組織學(xué)結(jié)構(gòu)分析

肝HE和油紅O染色切片可觀察到，22周齡時，肝呈實質(zhì)狀，此時肝細(xì)胞間無可明顯觀察的脂滴。30周齡時，番鴨肝細(xì)胞間有少量脂滴產(chǎn)生，至40周齡時，細(xì)胞間脂滴明顯增多，60周齡時肝細(xì)胞間脂滴顯著增加呈空泡狀，經(jīng)油紅O染色呈連片紅色。相對脂滴率在40和60周齡顯著高于22和30周齡(P<0.05，圖2)。

a.HE染色切片；b.油紅O染色切片；c.相對脂滴率。HE染色切片中，不同大小白色空泡代表脂滴；油紅O染色切片中，紅色圓圈滴代表脂滴(n=3)

2.3 產(chǎn)蛋各期番鴨AMPK通路基因表達(dá)分析

各基因在產(chǎn)蛋各期的表達(dá)量如表2所示，LKB1在30周齡表達(dá)量顯著低于22、40和60周齡(P<0.05)；CPT1在30、40和60周齡表達(dá)量顯著高于22周齡(P<0.05)；FAS在22和40周齡表達(dá)量顯著高于30周齡(P<0.05)；AMPKα1、HMGR、HNF4α、ACC1和SREBP1c在40周齡表達(dá)量顯著高于22和30周齡表達(dá)量(P<0.05)。

AMPK通路基因在產(chǎn)蛋各期表達(dá)量如表2所示。番鴨產(chǎn)蛋各期AMPKα1均處于本底水平低表達(dá)，并顯著低于產(chǎn)蛋各期CPT1和FAS表達(dá)量(P< 0.05)。番鴨22、40和60周齡肝FAS在AMPK通路各基因中的表達(dá)量最高。HNF4α和SREBP1c在產(chǎn)蛋各期表達(dá)量均處于較低水平。

表2 番鴨產(chǎn)蛋各期肝AMPK信號通路基因mRNA表達(dá)

2.4 番鴨產(chǎn)蛋各期肝脂肪酸組成分析

番鴨肝脂肪酸主要由13種脂肪酸組成(圖3)。產(chǎn)蛋各期肝組織中SFA、MUFA和PUFA主要由C16∶0、C18∶0、C18∶1 和C20∶2 n-6構(gòu)成，分別占總脂肪酸含量的32%、16%、30%和9%。C14∶0、C16∶0含量在40周齡顯著高于22周齡(P<0.05)；C24:0在60周齡含量為0.23 g·100 g-1，顯著高于22、30和40周齡(P<0.05)；C20∶2 n-6和∑PUFA含量在60周齡顯著高于22和40周齡(P<0.05，表3)。

表3 產(chǎn)蛋各期番鴨肝脂肪酸組成(n=3)

圖3 肝樣品GC-MS總離子圖

3 討 論

3.1 番鴨產(chǎn)蛋各期血液脂質(zhì)水平變化規(guī)律

番鴨產(chǎn)蛋期卵泡生長迅速，需要從血液中攝取大量極低密度脂蛋白和卵黃蛋白原等脂類物質(zhì)[3]。TC為血液中所有脂蛋白所含膽固醇總和，HDL具有促進(jìn)多余膽固醇從周圍組織運輸回肝，并最終排出體外的功能，LDL可將膽固醇從肝運輸至外周組織細(xì)胞[20-21]。禽類40周齡體成熟，蛋重達(dá)到平均蛋重，蛋重增加同時伴隨蛋黃重增加，需要肝向血液中輸出大量卵黃脂質(zhì)，因此，番鴨在40周齡時血液中TC和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低。血液中的TG在肝中合成，主要以VLDL形式運輸，最后以卵黃靶向的小型VLDLy的形式沉積在卵黃中[4]，故血清中TG和VLDL-C水平在各產(chǎn)蛋期變化規(guī)律相似，且在30和40周齡水平顯著高于22和60周齡。

3.2 番鴨肝脂肪沉積受日齡影響

不同于哺乳動物，禽類脂質(zhì)約90%于肝中合成。脂滴是脂質(zhì)和能量穩(wěn)態(tài)中心的貯藏細(xì)胞器，能促進(jìn)不同細(xì)胞器之間的協(xié)調(diào)和溝通，并為細(xì)胞代謝的重要樞紐[22]。脂肪肝的產(chǎn)生受飼料、飼喂的影響，隨日齡增加，亦會受肝臟代謝能力減弱的影響。番鴨開產(chǎn)后，隨著機(jī)體發(fā)育成熟和飼料攝入量增加，肝合成部分脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂滴以滿足卵泡增長需要。產(chǎn)蛋末期，肝中甘油三酯生物合成速度超過VLDL分泌至血液及肝內(nèi)脂肪酸氧化速度，過量的甘油三酯在肝積聚成脂滴。因此，隨著番鴨產(chǎn)蛋時間的增長，肝脂滴逐漸增大。

3.3 番鴨產(chǎn)蛋各期AMPKα1低表達(dá)以滿足肝脂質(zhì)合成需要

AMPK作為代謝主開關(guān)，已證實能夠顯著降低肝脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制肝脂質(zhì)生成[23]。CPT1為AMPK信號通路下游基因，為線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶[24]。從產(chǎn)蛋初期到產(chǎn)蛋結(jié)束，肝為滿足機(jī)體能量需求和脂質(zhì)合成需要，處于新陳代謝旺盛期。因此，CPT1在產(chǎn)蛋各期表達(dá)量較高。AMPK活化可抑制FAS表達(dá)，從而抑制肝脂肪酸合成[23]。本試驗中，AMPKα1本底水平低表達(dá)，以及FAS高表達(dá)，提示產(chǎn)蛋期肝脂肪合成可能是通過抑制AMPKα1進(jìn)而促進(jìn)FAS表達(dá)得以實現(xiàn)。22周齡時，卵巢原始卵泡激活，開始從血液中吸收大量富含蛋白質(zhì)的卵黃物質(zhì)，以發(fā)育成等級前卵泡，為卵泡選擇做準(zhǔn)備[25]，40周齡時處于產(chǎn)蛋高峰期，需要大量卵黃前體物來滿足卵泡快速生長需要，因此，F(xiàn)AS在22和40周齡表達(dá)量顯著高于30周齡。SREBP1c為一種關(guān)鍵的脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子，它直接激活多個基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸攝取和甘油三酯合成[26-27]。ACC1為肝脂肪從頭合成的限速酶，抑制肝ACC1表達(dá)會減少脂肪生成，增加脂肪酸氧化[28]。HMGR為膽固醇生物合成途徑中關(guān)鍵的限速酶[29]。HNF4α為一種核受體蛋白，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控與VLDL分泌相關(guān)的基因，在維持肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[30]。卵泡快速生長需要肝脂質(zhì)和固醇類等物質(zhì)，故40周齡SREBP1c、ACC1、HMGR和HNF4α表達(dá)量顯著高于22和30周齡。SREBP1c和HNF4α在產(chǎn)蛋各期表達(dá)量較低可能表明其在肝脂肪酸合成中起輔助作用。

3.4 番鴨產(chǎn)蛋中后期肝脂滴中長鏈脂肪酸增加

脂肪酸為TG和VLDL等脂類物質(zhì)重要組成部分，也是脂肪酸β-氧化的底物[31]。動物和植物組織中，以16和18個碳原子的脂肪酸最為豐富[31]，故本試驗中SFA主要由C16∶0和C18∶0組成，MUFA主要由C18∶1組成。C16∶0為TG和VLDL脂肪酸的重要組成部分，分別占總脂肪的25%和25.5%[32-33]。而TG和VLDL為產(chǎn)蛋期肝合成的重要脂類物質(zhì)，因此C16∶0在40周齡含量顯著高于22周齡。產(chǎn)蛋末期，肝臟中脂滴含量高于開產(chǎn)前、產(chǎn)蛋初期和產(chǎn)蛋中期，可能導(dǎo)致C24∶0含量在60周齡顯著高于其他3個時期，以及C20∶2 n-6含量在60周齡顯著高于22和40周齡。∑PUFA含量在60周齡顯著高于22和40周齡可能是由于C20∶2 n-6含量在60周齡顯著高于22和40周齡所致，C20∶2 n-6在PUFA中所占比例最高。

4 結(jié) 論

番鴨產(chǎn)蛋中期血清TC、TG、LDL-C及VLDL-C等血脂水平顯著增加，且肝脂滴沉積明顯。產(chǎn)蛋期通過下調(diào)AMPKα1表達(dá)，促進(jìn)肝脂質(zhì)合成相關(guān)基因FAS等表達(dá)上調(diào)，刺激長鏈脂肪酸合成，形成脂滴沉積于肝，并分泌至血液以增加血脂水平。