Glut4突變調控脂肪重分布及肌纖維重塑的機制研究

謝 寧，張凱藝，阮進學，2，陶 聰，吳添文，王彥芳，楊述林*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.華中農業大學動物科學技術學院，武漢 430070)

骨骼肌作為胰島素調節外周組織葡萄糖攝取的主要部位，其胰島素抵抗是糖尿病發生的重要原因之一[1]。骨骼肌作為動物機體能量消耗的主要組織，也是機體調節能量代謝的樞紐，可以根據不同的能量需求，快速在糖酵解、氧化磷酸化或脂肪酸氧化等能量產生方式間切換，以滿足不同能量需求的周轉[2-4]。與之相適應的是肌纖維異質性，保證了骨骼肌的這種代謝靈活性，例如，有氧運動增加骨骼肌的能量需求，促使肌纖維表型從快肌纖維向慢肌纖維轉化，以此滿足機體的能量需求[5]。骨骼肌還提供了通過增加運動量和以不依賴胰島素的方式攝取葡萄糖，恢復體內代謝平衡，為治愈2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)提供新的方法與思路[6]。提示，肌肉的適應性變化可能對疾病治療產生有益影響。

葡萄糖轉運蛋白4(Glut4)是骨骼肌和脂肪組織特異性表達的葡萄糖轉運載體，在胰島素調控下快速響應機體的血糖變化，對維持體內血糖穩定具有重要作用。Glut4由slc2a4基因編碼，是MFS(major facilitator superfamily)超家族成員之一，具有MFS共有的12個跨膜螺旋結構。Glut4還具有獨特的結構，其N端包含的苯丙氨酸殘基和C端包含的雙亮氨酸序列是參與胰島素應答和膜轉位的重要結構[7]，同時也是唯一響應胰島素信號，從囊泡結構中重新分布到質膜的轉運蛋白，其轉運缺陷是構成胰島素抵抗的基礎。基于Glut4是實現組織攝取葡萄糖的最后一步，以及它對胰島素的響應，因此被認為是糖尿病治療的關鍵靶點[8]。大量關于天然物質對降糖的研究都是基于改善Glut4的功能，例如花青素就是通過顯著改善了Glut4的表達，增加了Glut4的移位和葡萄糖的攝取從而用于血糖的維持[9]。針對Glut4在糖脂代謝及肌纖維重塑方面的作用已開展大量研究工作，例如，通過構建脂肪與肌肉Glut4敲除小鼠，發現肝臟葡萄糖攝取和脂肪合成均增加了，并且使得肌肉優先利用脂質供能來適應代謝的變化[10]。肌肉過表達Glut4的小鼠糖酵解增強，脂肪酸氧化減弱，在腓腸肌中IIb型肌纖維的比例與野生鼠相比減少28%，IIa型纖維比例增加11%[11]。基于以上對Glut4的研究發現，Glut4對糖尿病的治療至關重要，然而Glut4敲除后造成葡萄糖轉運載體缺失，不能進一步研究胰島素抵抗狀態下Glut4膜轉位調控機制及治療靶點篩選。

基于Glut4與家族成員在葡萄糖結合位點的高度同源性，以及通過Glut1逐點突變確定Gln161在葡萄糖結合中的關鍵作用[12-13]，本研究對Glut4的177位點進行點突變，獲得單個氨基酸突變的小鼠。通過研究Glut4突變對肌肉糖脂代謝及肌纖維重塑的影響，為2型糖尿病的治療及家畜生產提供模型及參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在Ensemble網站上查找基因編號為ENSMUSG00000018566的slc2a4基因序列，利用CRISPR/Cas9在其第五外顯子上將距5′-UTR 2 110位 的堿基A突變為T，質粒載體委托協和醫院構建。健康22周齡C57BL/6 J小鼠分為野生型(Glut4+/+)和Glut4基因純合突變鼠(Glut4m/m)。小鼠飼養在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所獸醫實驗動物房，室內溫度(22±2)℃，相對濕度40%～70%，自由進食與飲水。

1.2 試劑與儀器

KAPA Express Extract DNA Extraction Kit(羅氏)；胰島素試劑盒(Mercodia)；瘦素試劑盒、脂聯素試劑盒(R&D)；20%葡萄糖溶液(北京北方生物技術研究所有限公司)；精蛋白生物合成人胰島素注射液(SIGMA)；RTIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒(TaKaRa)；Invitrogen PowerUpTMSYBR?Green Master Mix熒光定量試劑盒(北京冬歌博業生物科技有限公司)；組織蛋白提取試劑(賽默飛世爾科技)；電泳液、轉膜液、PVDF膜(北京博通興業生物科技有限公司)；AMPK-ɑ抗體、兔抗Thr172磷酸化AMPKα 抗體(CST)；Glut4 抗體(Abcam)。

血糖儀及血糖試紙(強生)；普通PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統、電泳槽(Bio-Rad)；Nano100微量分光光度計(奧盛)；熒光定量PCR儀(ABI)；高速冷凍離心機(Eppendorf)；組織勻漿儀(Bertin technologies)；制冰機(SANYO)。

1.3 方法

1.3.1 鼠基因型的鑒定 取小鼠尾尖2 mm3的組織塊，使用KAPA Express試劑盒快速抽提小鼠DNA：EP管中加入10×KAPA Quick Extract Buffer 5 μL、ddH2O 44 μL、KAPA Quick Extract Enzyme 1 μL，共50 μL。PCR儀設置程序：75 ℃ 15 min，95 ℃5 min，12 ℃ 30 s。從獲取的DNA上清中取2.5 μL，加入2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物(上游引物: 5′-TTGGACGGTTCCTCATTGGC-3′,下游引物: 5′-GCTCTTCCTTCCAGCCCAAAT-3′)各1 μL，ddH2O 5.5 μL。設置程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，72 ℃ 10 min，34個循環。將得到的PCR反應產物送天一輝遠公司測序。

1.3.2 血清學指標的測定 小鼠摘眼球法采血，處死小鼠，血樣3 000 r·min-1離心10 min，取上清，根據試劑盒說明書規范操作檢測胰島素、脂聯素、瘦素水平，使用日本奧林巴斯株式會社全自動生化儀檢測甘油三酯的含量。

1.3.3 糖耐量與胰島素耐量水平檢測 配置20%的葡萄糖溶液，小鼠空腹禁食16 h，每只小鼠腹腔注射0.01 mL·g-1的葡萄糖，使用血糖儀分別在15、30、60、90、120、150 min檢測血糖并記錄。使用GraphPad Prism 8.0計算葡萄糖曲線下面積(AUC)，AUC值越大，代表小鼠降血糖的能力越差，糖耐量水平越差。

配置0.1 U·mL-1胰島素溶液，小鼠空腹禁食4 h，每只小鼠腹腔注射0.1 U·mL-1的胰島素溶液，在15、30、45、60、90 min測定每只小鼠各個時間點的血糖值，同上述步驟計算AUC。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 使用Trizol傳統方法提取RNA，即TRIzol破碎細胞、降解細胞，氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉管后用異丙醇沉淀RNA，75%酒精分離提純獲得總RNA。Nana100測定RNA濃度后，使用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA。借助SYBRTMSelect Master Mix試劑盒，反應體系為SYBR染料10 μL, 上、下游引物(表1)各1 μL, ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s, 60 ℃ 34 s, 共40個循環，最后得到擴增曲線，用內參18S校正后，計算基因的表達量。

表1 熒光定量引物序列

1.3.5 蛋白質印跡檢測蛋白表達 取100 mg腓腸肌組織，加入400 μL含有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的裂解液，勻漿機破碎組織，冰上孵育30 min后離心4 ℃ 12 000 r·min-1，30 min吸取上清獲得蛋白。蛋白變性后，經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟得到蛋白成像圖。使用ImageJ 軟件分析目標條帶灰度值。

1.4 統計學分析

所有試驗均進行平行試驗檢測，數據結果表示為“平均值±標準差”，血清學檢測、基因的表達與蛋白檢測均采用獨立樣本t檢驗分析顯著性，P<0.05認為具有統計學意義。使用GraphPad Prism 8.0繪圖，使用Image J軟件進行灰度分析。

2 結 果

2.1 Glut4突變鼠的制備與陽性鑒定

為降低小鼠骨骼肌和脂肪組織葡萄糖攝取能力，針對受胰島素調控的Glut4葡萄糖結合關鍵位點進行點突變。已有報道表明，將Glut4第177位谷氨酰胺(Q)為突變為賴氨酸(L)，Glut4的葡萄糖轉運能力下降至原來的5%～10%[14]。根據slc2a4的基因序列，在第五外顯子上設計CRISPR/Cas9的靶向gRNA，切割后經靶向序列修復將導致Glut4第177位Q→L的單氨基酸突變(圖1A)。將gRNA與Cas9蛋白構建載體，顯微注射到小鼠受精卵，制備Glut4Q177L單氨基酸突變的小鼠。以包含突變位點片段兩側的序列為參考設計引物，PCR擴增產物測序鑒定陽性個體，圖1B顯示，靶點處單峰A為野生型，單峰T為Glut4突變純合子。

A.slc2a4基因結構圖；B.測序峰圖，上方為野生型小鼠序列，下方為Glut4純合突變小鼠序列

2.2 Glut4突變鼠表型評價

2.2.1 體重與組織稱重 為評價Glut4突變限制脂肪和骨骼肌葡萄糖攝取能力后機體的生長發育能力，對22周齡兩組小鼠的體重及皮下脂肪、褐色脂肪、附睪脂肪、胰腺、肝臟、腎臟、腸系膜脂肪、心臟、心周脂、腎周脂以及右后側肢分別進行稱重。結果顯示，突變小鼠體重((23.37±0.75)g)極顯著低于野生型小鼠((28.47±0.31)g)(P<0.01,圖2A)，其中皮下脂肪、附睪脂及腸系膜脂重量相對于體重的比例顯著改變，分別從野生型1.91%、2.18%和0.97%下降到1.37%、1.20%和0.46%(P<0.05,圖2B)。除此之外，突變鼠的心臟、肝臟有代償增大的趨勢，同時，腿部肌肉占體重比例有增加趨勢，但是在22周齡未達到顯著水平。突變鼠內臟脂肪與皮下脂肪的減少表明Glut4基因突變可能改變了脂質的分布與利用。

*.P<0.05；**.P<0.01,下同

2.2.2 突變鼠糖耐量受損 為評價Glut4突變對全身葡萄糖攝取能力的影響，對22周齡小鼠的糖耐量與胰島素耐量進行了評價。糖耐量結果顯示，野生型小鼠在注射葡萄糖15 min后血糖達到最高值隨后下降，而突變鼠在30 min達到最高，血糖下降的延遲說明突變鼠胰島素對糖的響應能力減弱(圖3A)，進一步分析葡萄糖曲線下面積顯示，突變鼠的曲線下面積極顯著大于對照(P<0.01，圖3B)。同時，胰島素耐量結果顯示，突變鼠注射胰島素后血糖下降緩慢，且曲線下面積極顯著大于對照組(P<0.01，圖3C，D)。以上結果說明，Glut4基因突變后延緩了血糖的處理速度，血糖下降困難，造成突變鼠的糖代謝紊亂。

圖3 糖耐量與胰島素耐量血糖值與曲線下面積

2.2.3 血清學指標 動物個體糖代謝與脂代謝密切相關，組織間通過分泌激素或細胞因子進行相互調控，為此，本研究測定了兩組鼠血清學甘油三酯、胰島素、脂聯素和瘦素等的變化情況。突變鼠血清中甘油三酯的含量((0.77±0.11)mmol·L-1)顯著低于對照組((1.20±0.21)mmol·L-1)(P<0.05，圖4A)，提示突變鼠可能對外周脂質的利用增加，而血清中的胰島素、脂聯素和瘦素組間差異不顯著(圖4B～D)。

圖4 Glut4突變后小鼠血清指標的變化

2.3 Glut4突變鼠的其他葡萄糖轉運蛋白的表達

為了解Glut4突變對機體攝取葡萄糖的影響，對腓腸肌中多個葡萄糖轉運蛋白的表達量進行了檢測，結果顯示，Glut4的表達量最高，其次是Glut12。Glut4基因突變后，Glut4、Glut1和Glut12表達量出現顯著升高(P<0.05，圖5)，說明在糖攝取不足時機體會增加轉運蛋白的表達，代償葡萄糖的攝取，以此維持葡萄糖的穩態。

圖5 轉運蛋白相關基因mRNA表達

2.4 Glut4突變鼠骨骼肌脂質分解與利用相關基因的表達

為了解Glut4突變骨骼肌糖攝取降低后，骨骼肌是如何滿足機體能量供應的，進一步對能量需求調控通路及脂代謝過程進行評價。結果顯示，調控能量代謝的5′-腺苷一磷酸激活蛋白激酶(AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1(PGC-1α)，胰島素信號通路中的胰島素受體底物(IRS)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)，脂代謝相關基因的脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂肪酶(HSL)、二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)、白細胞分化抗原36(CD36)、心型脂肪酸結合蛋白(hFABP4)和脂肪酸轉運蛋白(FATP)基因，及肌肉細胞因子鳶尾素(Irisin)和白介素6(IL-6)等基因均顯著上調表達(圖6A)。上述結果表明，突變鼠在葡萄糖攝取不足的情況下會增強脂質動員相關基因的表達，且Glut4突變后機體利用能量的底物發生改變，促使脂肪酸的消耗與利用增強。為進一步確定AMPK的激活程度，通過蛋白免疫印跡方法檢測顯示，突變鼠的AMPK與pAMPK表達量均顯著高于對照組(P<0.05，圖6B)，因此，Glut4基因突變后可以通過激活AMPK來加強對能量物質的動員。

圖6 脂代謝相關基因的mRNA表達(A)與AMPK蛋白及磷酸化水平(B)

其次，為了解Glut4突變是否對其上游胰島素通路有影響，對胰島素信號通路的兩個關鍵基因IRS和PI3K進行檢測，二者的表達量均極顯著增加(P<0.01)，說明Glut4突變后使得小鼠的胰島素敏感性增強。

此外，為了明確Glut4突變是否會對肌細胞因子產生影響，本研究還檢測了肌細胞因子，發現Irisin和IL-6的水平極顯著升高(P<0.01)。Irisin最早在骨骼肌中被發現，具有脂肪細胞棕化的作用；IL-6是重要的炎性因子，同時也是最早被鑒定的肌細胞因子，運動后的骨骼肌分泌IL-6，通過血液循環調控脂肪組織分解供應能量。二者表達的增加提示突變鼠可能處于能量消耗增加狀態。

2.5 Glut4突變鼠慢肌纖維相關基因的表達

為了進一步確定突變鼠機體能量底物發生變化對肌肉的影響，本研究檢測了22周齡小鼠腓腸肌的肌纖維類型相關基因的表達情況。如圖7所示，突變鼠I型肌纖維MyHCI和快IIa型肌纖維MyHCIIa表達極顯著高于對照組(P<0.01)，而IIb型肌纖維MyHCIIb的表達顯著低于對照組(P<0.05)，并且參與調控肌肉發育的肌細胞增強子因子2C(MEF2C)水平顯著升高(P<0.05)。

圖7 肌纖維類型相關基因的mRNA表達

3 討 論

3.1 葡萄糖轉運蛋白的代償表達

葡萄糖轉運蛋白是哺乳動物細胞中輔助葡萄糖轉運的主要介質。其中，Glut1具有與基礎血糖相近的Km值，維持全身各組織在血糖穩態調節中的功能。Glut2對葡萄糖具有低親和力和高轉運率，對高糖環境敏感，有助于肝臟高效發揮血糖調節功能。Glut3的底物親和力最高，保持中樞神經系統優先利用葡萄糖。Glut4是I組唯一胰島素敏感的轉運蛋白[15]。研究報道顯示，肌肉中葡萄糖轉運蛋白總共有7個：Glut4、Glut5、Glut12、Glut8、Glut11、Glut3和Glut1，且在慢肌中Glut4、Glut5和Glut12的豐度最高[16]。與這一研究相似的是本研究發現在小鼠腓腸肌中Glut4、Glut12和Glut1的豐度遠高于其他轉運蛋白。

Glut4的含量對于血糖調控至關重要，研究發現，肌肉特異性Glut4缺失小鼠的肌肉葡萄糖攝取量顯著降低[17]，此外，骨骼肌或者脂肪特異性敲除Glut4均會導致全身胰島素抵抗[18]。Glut4的過表達通過將高水平的Glut4蛋白轉移到細胞表面來緩解胰島素抵抗，導致血糖控制的顯著改善[19]。本試驗發現，Glut4的表達增加反映了其調控血糖的重要性。

胰島素抵抗被認為是2型糖尿病發生的關鍵原因，而Glut4無法響應胰島素抵抗是這種紊亂的促成因素。報道顯示，2型糖尿病患者中Glut4在慢肌纖維的豐度與健康對照組相比降低了18%[20]；而肌肉特異性敲除Glut4的小鼠在胰島素刺激，骨骼肌的葡萄糖攝取沒有受到損害，推測可能存在其他轉運蛋白的代償作用[21]。在本研究中，Glut4突變后Glut4、Glut1和Glut12表達顯著升高，驗證了在糖攝取不足情況下轉運蛋白的代償效應，然而，這種代償作用不能完全替代Glut4的功能，從而表現出胰島素抵抗特征。報道顯示，基因編輯Glut4缺失13 bp的3T3-L1中發現，Glut1表達增高而葡萄糖攝入量顯著低于對照組[22]。

3.2 Glut4基因突變可改變骨骼肌能量供應底物和促進脂質利用

糖耐量是評價機體對血糖穩態調節能力和對葡萄糖敏感性的指標[23]。本研究中，Glut4基因突變導致糖耐量受損，表明突變鼠減少葡萄糖作為能量物質的利用，反映出Glut4在血糖調節中具有重要作用，這一結果與T2DM患者Glut4表達降低或膜轉位障礙引起的糖耐量受損一致，表明Glut4突變可以模擬T2DM患者中Glut4功能障礙的病理機制。

葡萄糖和甘油三酯是細胞內能量供應和儲存的主要來源。肌肉具有轉換能量底物的代謝靈活性[24]。Kotani等[10]構建脂肪和肌肉Glut4敲除小鼠，觀察到口服脂質灌胃后小鼠呼吸熵降低且血清脂質清除增加，發現Glut4敲除后小鼠肌肉優先利用脂質燃料來適應糖的供應不足。本研究中，脂肪水解(ATGL)和脂肪酸攝取、結合(CD36、FATP、hFABP4)相關基因均表達增加，表明Glut4突變降低葡萄糖攝取后，可促使小鼠能量底物從葡萄糖轉變為脂肪酸，通過增加脂肪酸的利用以滿足能量需求。AMPK作為能量調節的關鍵信號通路，可通過調節合成代謝和分解代謝途徑來維持能量的平衡[25]。AMPK通過磷酸化ATGL促進脂肪的吸收和釋放，激活的AMPK還可以招募肌膜上脂肪酸轉運蛋白CD36以此增加游離脂肪酸的攝取[26]，以及增加FATP4和FABP4的表達，促進能量的生成[27]。本研究中，AMPK以及其下游ATGL、FATP4和FABP4的表達水平均顯著升高，說明Glut4突變小鼠對脂質的利用增加是通過激活AMPK通路完成的。

AMPK除了直接對甘油三酯進行分解以及促進游離脂肪酸的利用外，還能促進Irisin的表達[28]。Irisin是2012年發現的肌細胞因子，前體是FNDC5蛋白，由于Irisin具有促進白色脂肪棕色化的減肥作用而廣受關注[29]。Irisin被認為是PGC-1α依賴性肌因子，Bostr?m等[30]觀察發現，運動可以通過促進PGC-1α刺激Irisin的表達，進而促進能量的消耗。肌肉特異性AMPKα2基因敲除小鼠導致FNDC5 mRNA水平降低[31]。因此AMPK-PGC-1α-Irisin在調控能量方面發揮重要的作用[32]。同樣，在本研究中觀察到AMPK、PGC-1α、Irisin基因均上調表達，提示Irisin在Glut4突變鼠調節能量代謝方面也起到積極作用。

Glut4突變鼠為了適應葡萄糖攝取的不足，改變能量底物，進而導致了脂質的重分布。食物來源的脂肪經消化分解后主要儲存在脂肪組織，而Glut4突變鼠內臟脂肪與皮下脂肪組織重量減少，脂肪酸更多的流入肌肉組織，分解供能。因此Glut4突變影響了能量代謝與脂質的重分布。

3.3 Glut4基因突變增加氧化型慢肌纖維比例以適應糖攝取不足

骨骼肌是由不同纖維類型組成的異質組織，對全身胰島素刺激的葡萄糖代謝具有重要作用。不同類型肌纖維具有不同的葡萄糖代謝方式，I型纖維肌肉表達較高的胰島素受體和Glut4，具有更高的葡萄糖處理能力，其胰島素刺激的葡萄糖攝取量高于高度糖酵解II型纖維的肌肉，而II型纖維葡萄糖的氧化能力、Glut4的豐度以及對胰島素的響應都弱于I型纖維[33]。通過底物感測、運輸、存儲和利用來有效適應新陳代謝的能力被稱為代謝的靈活性[34]。代謝的靈活性對于能量過多或能量限制時以及在運動過程中能量需求變化時對維持能量穩態至關重要[35]。骨骼肌具有代謝靈活性，其靈活性體現在當代謝發生變化時，可以通過肌纖維的轉化來滿足能量需求的變化，因此在代謝疾病方面，肌肉的靈活性在疾病初期具有重要作用[36]。短期飼喂高脂飼料，小鼠出現促進氧化性纖維表達以緩解高脂飲食帶來的能量負荷的適應性變化[37]。糖尿病患者骨骼肌的形態與肌纖維類型會發生改變，疾病狀態下導致氧化磷酸化障礙和更高的快肌纖維含量[38]。本研究發現，慢肌纖維表達增加，促進脂質的消耗，這種適應性變化可能有利于糖尿病早期的改善[28]。

此外，肌細胞增強因子家族成員MEF2C與PGC-1α在慢肌纖維的表達中發揮重要調控作用[39]。PGC-1α是調控能量生成的重要轉錄因子，可以與MEF2相互作用，研究發現，經跑步訓練后的大鼠PGC-1α和MEF2的表達顯著增高并伴隨慢肌纖維的表達增加[40]。因此，Glut4基因突變后機體可能通過PGC-1α與MEF2促進肌纖維的轉化，增加脂質的有氧氧化過程，以此適應葡萄糖的攝取不足。

4 結 論

本研究通過CRISPR/Cas9技術獲得單堿基突變的Glut4Q177L突變鼠，造成骨骼肌和脂肪組織的葡萄糖攝取障礙。研究發現，突變鼠通過增加皮下脂肪的分解以及慢肌纖維的生成，提高脂肪酸利用和氧化效率來適應葡萄糖供應不足。Glut4Q177L突變鼠作為骨骼肌和脂肪組織Glut4功能障礙的胰島素抵抗模型，解析其適應胰島素抵抗及促進脂質利用的潛在機制有助于為2型糖尿病的治療提供參考。同時，突變鼠的脂肪含量減少與慢肌纖維增多符合畜牧生產實踐中降低皮下脂肪含量和改善肉質的發展需求，因此本試驗結果也為分子育種提供了新的思路。