不同蛋白源日糧添加乳酸鏈球菌素對育肥湖羊瘤胃發酵及微生物菌群結構的影響

姜 君, 孫美杰, 申軍士*, 刁其玉, 朱偉云

(1.國家動物消化道營養國際聯合研究中心 江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室 南京農業大學消化道微生物研究室，南京 210095；2.中國農業科學院飼料研究所 農業農村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081)

乳酸鏈球菌素(nisin)是一種主要抑制革蘭陽性菌的小分子多肽類羊毛硫細菌素，由34個氨基酸組成，分子量為3.5 ku。早在1969年，nisin就被聯合國糧食及農業組織(FAO)和世衛組織(WHO)批準作為食品添加劑。截至目前，nisin仍在防控食品微生物污染中作為常用添加劑，是現在研究較為透徹且最為商業化的細菌素[1]，但此前有報道稱，將其替代抗生素應用于肉雞生產中也取得了良好效果[2-3]。本課題組前期體外研究結果表明，適宜濃度的nisin和莫能菌素處理均可以改變瘤胃發酵類型，增加丙酸摩爾濃度，但與莫能菌素處理相比，nisin能在顯著抑制甲烷生成的同時而不影響飼料消化率[4]。通過進一步微生物組學分析發現，造成莫能菌素處理組中瘤胃干物質消化率顯著降低而nisin處理組沒有顯著影響的原因與瘤胃功能菌群數量及多樣性的變化密切相關[5]。然而，體外模擬瘤胃發酵的底物含量及微生物數量比實際瘤胃內環境低很多[6]，考慮到體內外試驗條件的差異，還需進一步開展體內的動物飼養試驗來對nisin通過調控瘤胃微生物改善瘤胃發酵的有效性進行驗證。

近年來,隨著畜牧業不斷發展，家畜與人類對食物的競爭不斷加大，降低飼料中人類可食用成分的比例有助于緩解我國人畜爭糧的矛盾，而非常規飼料的應用則一定程度上緩解了這種壓力，De Evan等[7]使用干玉米酒精糟及其可溶物(DDGS)等非常規飼料代替羔羊飼料中44%的精料，發現飼料中人類可直接食用成份下降了27.7%。DDGS是玉米等谷物經酵母和酶發酵生產乙醇后的工業副產品，具有高蛋白、高脂肪、高能量及低成本的特點[8]，且隨著近十年來我國DDGS產量穩步增多(增幅達108.8%[9])，其作為豆粕(soybean meal，SBM)替代物來緩解我國飼料蛋白資源緊缺也是一種潛在手段。本課題組前期飼養試驗結果表明，DDGS替代全部豆粕和部分玉米并未對育肥期湖羊的生長性能產生不利影響[10]。然而，此前關于DDGS對瘤胃微生物影響的研究主要集中于奶牛和肉牛[11-13]，對育肥期湖羊瘤胃微生物的研究鮮有報道。日糧變化影響瘤胃微生物菌群結構[14-15]，而微生物對宿主代謝穩態也起到關鍵作用[16]。因此，了解營養調控措施對微生物的影響以及微生物與宿主之間的互作關系，對于提高動物生產性能具有重要意義。本研究假定，不同蛋白源日糧添加nisin對育肥湖羊瘤胃發酵及微生物菌群結構會產生影響，并應用Illumina Miseq測序及Real-time qPCR等技術對其進行探究，旨在為DDGS替代豆粕作為日糧蛋白源以及nisin替代抗生素在反芻動物生產中的應用提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用nisin(浙江某生物工程公司)標準品組成：2.5% nisin、77.5% NaCl和20%脫脂奶粉；活性：≥1×106IU·g-1；產品批號：150514。Nisin在本試驗中的添加量是基于申軍士等[4]體外研究結果而定，添加30.5 mg·kg-1DM(假定試驗動物干物質采食量(dry matter intake, DMI)=1 150 g·d-1，且瘤胃容積約為5 L)nisin在湖羊瘤胃中濃度約為2 μmol·L-1。

1.2 試驗設計及日糧配方

試驗采用2×2因子設計，兩因子分別為蛋白源[豆粕、DDGS]和nisin(添加水平為0或30.5 mg·kg-1DM)，兩兩組合，配制4種等氮等能日糧：豆粕日糧(豆粕=12% DM日糧)、豆粕日糧中添加30.5 mg·kg-1DM nisin、DDGS日糧(DDGS=20% DM日糧)、DDGS日糧中添加30.5 mg·kg-1DM nisin。豆粕與DDGS的粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和粗脂肪含量(干物質基礎百分比)分別為：50.1%和30.9%，17.3%和37.5%，9.0%和18.3%，3.1%和12.7%[10]。參照中華人民共和國農業部發部的肉羊飼養標準(2004)營養需要配制各組日糧，DDGS替代了日糧中所有的豆粕和部分玉米粉料，具體日糧配方及營養水平與本課題組此前同批動物飼養試驗一致[10]。

32只體重為(23±2.0)kg的湖羊公羔采取2×2析因隨機區組試驗設計，根據體重分為2個區組(低體重組，16只；高體重組，16只)，每個區組的湖羊隨機分配到4個組，單欄飼養。每組隨機分配到4種不同日糧處理，整個試驗期共10周(包括1周適應期和9周正式試驗期)，每日7:00和19:00飼喂全混合日糧(TMR)，保證剩料率在5%～10%，自由飲水。在正式試驗期結束時，從各處理組中隨機選取6只(低體重組，3只；高體重組，3只)湖羊(共24只)進行屠宰取樣。

1.3 樣本采集

在正式試驗開始及第9周時連續3 d于晨飼前準確稱量每只羊的體重，數據用于試驗湖羊平均日增重(ADG)的計算。ADG=(末期平均體重-初始平均體重)/時間間隔。

在試驗期結束前2 h，各試驗組湖羊于晨飼后4～6 h進行屠宰。屠宰后，將瘤胃沿底部中線剪開并立即把內容物取出分裝。一份瘤胃內容物樣品直接置于10 mL離心管中，然后置于-20 ℃保存，用于瘤胃內容物DNA提取。一份內容物樣品參照申軍士等[4]的方法經四層紗布過濾，濾液立即用便攜式pH計(Ecoscan pH 5, Eutech Instruments, 新加坡)測量瘤胃液pH，剩余內容物再分裝兩份，-20 ℃保存。參照申軍士等[4]的方法處理樣品后使用氣相色譜儀(7890A，安捷倫，英國)測定揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)；參照Chaney和Marbach[17]的比色法測定氨態氮濃度。

取出瘤胃，移除瘤胃內容物后用生理鹽水將瘤胃壁沖洗干凈稱重并記錄(瘤胃重)，最后稱量湖羊胴體重并計算屠宰率。屠宰率=胴體重/屠體重×100%。

1.4 瘤胃內容物DNA提取

瘤胃內容物樣品解凍后，參照Dai等[18]的方法，經十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、bead-beating和DNA提取液(酚-氯仿-異戊醇)處理后，提取瘤胃內容物中微生物的總DNA。DNA提取物首先采用1.2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳并經GoldviewTM(SaiBaiSheng，上海)染色后直觀檢測DNA質量，再經NanoDrop 2000c分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)測定DNA濃度(ng·μL-1)以及260 nm與280 nm OD比值(1.8～2.0)。DNA樣品-20 ℃保存。

1.5 瘤胃內容物Real-time PCR定量

參照申軍士等[4]的方法構建20 μL反應體系(10 μL SYBR GREEN、0.4 μL ROX、0.4 μL引物F、0.4 μL引物R、6.8 μL雙蒸水、2 μL DNA模板)，使用ABI7500 Real-time PCR儀對瘤胃內容物中的總菌[19]、真菌[19]、原蟲[20]、甲烷菌[21]、斯氏梭菌[22](Clostridiumsticklandii)和Clostridiumaminophilum[22]進行定量分析。分別以總菌、C.sticklandii和C.aminophilum的16S rRNA基因，以真菌和原蟲的18S rRNA基因，以甲烷菌的甲基輔酶M還原酶(mcrA)基因構建質粒并以此作為模板制作各目標菌定量的標準曲線。

1.6 瘤胃細菌Illumina-MiSeq測序

選取細菌通用V3-V4可變區域為目的片段，對瘤胃內容物細菌DNA進行PCR擴增。在擴增過程中引入不同樣本的接頭Barcode(8 bp堿基序列)和測序引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。擴增完成后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，檢驗合格后使用AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，美國)提取和純化預期條帶，隨后使用QuantiFluor?dsDNA試劑盒(Promega,美國)對DNA純化物進行質量檢測。在Illumina-MiSeq平臺上，按要求將不同樣本的擴增產物按等比例混合并測序。測序完成后，所有數據按如下過程處理：原始fastq數據去除barcode和引物序列，使用QIIME 1.9.1軟件進行質量過濾及片段拼接。使用UPARSE(版本7.1)以97%的序列相似性截斷對操作分類單元(OTUs)進行重新聚類，并運用UCHIME算法識別和刪除可能嵌合的序列。選定每個OTU中最豐富的序列為代表序列，然后基于SILVA數據庫(版本128)進行分類比對，并使用FastTree軟件構建系統發育樹。采用QIIME1.9.1軟件計算覆蓋度、豐富度及多樣性指數。

1.7 數據分析

使用相似性分析(ANOSIM)對不同主因素間瘤胃細菌PCoA分析差異顯著性進行統計；對瘤胃功能菌群實時定量PCR數據進行對數轉換以提高其正態性；使用SAS軟件(Vsrsion 9.4)進行殘差分析用于確定不同統計數據是否需要轉換，然后使用SAS混合模型(Mixed)對湖羊屠宰性能指標、瘤胃發酵參數、瘤胃功能菌群數量、瘤胃細菌α多樣性以及瘤胃細菌門和屬水平的相對豐度等進行統計分析，其中蛋白源、nisin、蛋白源×nisin(Pro×Nis)為模型固定效應，區組、羊(Pro×Nis)為隨機效應。使用Kenward Roger選項計算自由度，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 屠宰性能變化

由表1可知，日糧蛋白源與nisin對湖羊屠宰性能指標(平均日增重、胴體重、屠宰率及瘤胃重量)沒有交互作用(P≥0.24)。DDGS替代豆粕作為蛋白源(P≥0.18)以及日糧添加nisin(P≥0.08)均不影響湖羊屠宰性能。

表1 不同日糧蛋白源添加nisin對育肥湖羊屠宰性能的影響

2.2 瘤胃發酵參數變化

由表2可知，日糧蛋白源與nisin添加對育肥湖羊瘤胃發酵參數沒有交互作用(P≥0.27)；使用DDGS替代豆粕作為蛋白源會顯著降低湖羊瘤胃中氨態氮(P<0.05)、乙酸(P<0.05)及總支鏈脂肪酸(Branch-chain VFA, BCVFA)(P<0.05)的濃度；日糧添加nisin對湖羊瘤胃發酵參數無顯著影響(P≥0.11)。

表2 不同日糧蛋白源添加nisin對育肥湖羊瘤胃發酵參數的影響

2.3 功能菌群數量變化

由表3可知，日糧蛋白源與nisin對育肥湖羊瘤胃功能菌群數量不存在交互作用(P≥0.42)；使用DDGS替代豆粕會顯著降低育肥湖羊瘤胃中原蟲及C.aminophilum數量(P<0.05)，而瘤胃總菌、真菌及甲烷菌的數量無顯著差異(P≥0.053)；日糧添加nisin對瘤胃功能菌群的數量并無顯著影響(P≥0.09)。各處理組中并未檢測到有C.sticklandii的存在。

表3 不同日糧蛋白源添加nisin對育肥湖羊瘤胃功能菌群數量的影響

2.4 瘤胃菌群α多樣性

由表4可知，在育肥湖羊瘤胃細菌α多樣性各指標中，日糧蛋白源與nisin沒有交互作用(P≥0.08)；日糧使用DDGS替代豆粕作為蛋白源的ACE和Chao1指數顯著升高(P<0.05)，而對Shannon指數無顯著影響(P=0.41)；日糧添加nisin不顯著影響瘤胃細菌的α多樣性(P≥0.06)。

表4 不同日糧蛋白源添加nisin對育肥湖羊瘤胃細菌菌群α多樣性的影響

2.5 瘤胃菌群β多樣性

基于Bary-Curtis距離算法的主坐標分析(PCoA)結果見圖1。結果表明，不同日糧蛋白源對育肥湖羊瘤胃細菌組成并未有顯著影響(P=0.16)，而日糧添加乳酸鏈球菌素具有改變瘤胃細菌群β多樣性的趨勢(P=0.055)。

2.6 瘤胃細菌相對豐度

不同處理組瘤胃細菌門水平相對豐度見表5。瘤胃內容物中的細菌主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋菌門(Spirochaetae)、放線菌門(Actinobacteria)、纖維菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)組成。各處理組優勢菌門均為Bacteroidetes(45.58%～50.61%)和Firmicutes(45.37%～48.89%)，二者相對豐度占瘤胃菌群的94.47%及以上；日糧蛋白源與nisin對育肥湖羊瘤胃細菌門水平相對豐度沒有交互作用(P≥0.17)；日糧蛋白源與添加nisin均不影響瘤胃細菌門水平相對豐度(P≥0.14)。

表5 不同日糧蛋白源添加nisin對育肥湖羊瘤胃細菌門水平相對豐度(至少一個處理相對豐度>0.5%)的影響

不同處理組瘤胃細菌屬水平相對豐度見圖2。各處理組的主要優勢菌屬均為Prevotella1：(23.78%～33.33%)、ChristensenellaceaeR-7 group(12.14～13.93%)和RuminococcaceaeNK4A214 group(5.73～7.84%)。試驗結果表明，對于瘤胃RuminococcaceaeNK4A214 group和UnclassifiedBacteroidetes相對豐度來說，日糧蛋白源與nisin存在交互作用(P<0.05),UnclassifiedBacteroidetes的相對豐度在SBM-nisin組中最高；日糧使用DDGS替代豆粕作為蛋白源Butyrivibrio2和RuminococcaceaeUCG-005的相對豐度顯著降低(P<0.05)，而Pseudobutyrivibrio和Roseburia的相對豐度顯著增加(P<0.05)；日糧添加nisin對育肥湖羊瘤胃細菌屬水平相對豐度沒有顯著影響(P≥0.06)。

左圖為瘤胃細菌屬水平相對豐度柱狀圖(至少有一組相對豐度>1%)；右圖柱狀圖為瘤胃細菌屬水平在蛋白源、nisin或二者交互作用具有顯著差異的所有菌屬(至少有一組相對豐度>0.5%)；Pro×Nis表示蛋白源與乳酸鏈球菌素的交互作用

3 討 論

3.1 日糧添加nisin對育肥湖羊屠宰性能、瘤胃發酵參數及微生物區系的影響

Nisin在反芻動物瘤胃調控中的體內試驗研究報道較少，但是對單胃動物(主要集中在肉雞上)腸道菌群及發酵參數的影響研究已有諸多報道[2-3,23]。Kierończyk等[3]對400只雌雞回腸內容物進行qPCR分析，結果表明，日糧補充nisin的肉雞回腸內擬桿菌屬——普雷沃氏菌屬蔟(Bacteroides-Prevotellacluster)以及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)等潛在致病菌的數量顯著降低，引起了消化道菌群的顯著變化。Józefiak等[23]發現，nisin可以顯著降低肉雞回腸中短鏈脂肪酸(SCFA)的濃度，以及擬桿菌屬(Bacteroides)和腸桿菌科(Enterobacteriacae)的數量。本課題組前期體外模擬瘤胃發酵的研究成果表明，nisin的添加顯著影響了瘤胃發酵參數，通過選擇性抑制瘤胃中甲烷菌的方式來減少甲烷的生成，莫能菌素的添加會降低DM消失率但nisin不影響[4-5]。通過進一步微生物組學分析發現nisin對瘤胃DM消化率沒有影響的原因與瘤胃功能菌群數量與多樣性的變化密切相關[5]。在本研究中，日糧添加30.5 mg·kg-1DM nisin不影響育肥湖羊屠宰性能及瘤胃發酵參數，并且對瘤胃微生物區系影響很小，與先前體外研究成果不一致[4-5]。此前有研究報道，體外模擬瘤胃試驗中底物含量以及微生物的數量(包括細菌、真菌、原蟲等)遠低于實際瘤胃內環境[6, 24]，這說明體外試驗的結果不能簡單的推導到體內。因此推測，本研究中nisin未達到預期效果可能是添加劑量不足導致。除劑量問題外，乳酸鏈球菌素作為一種肽類物質其活性在復雜的瘤胃內環境中是否能保持穩定也值得思考，有研究報道稱，乳酸鏈球菌素的穩定性取決于其所處環境和環境中酶的性質[25]。瘤胃是一個復雜的動態生態系統，其中棲息的種類繁多的微生物可以分泌多種活性酶，如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等，從而協助宿主降解日糧中營養物質，據此推測，乳酸鏈球菌素的活性可能在復雜瘤胃代謝過程中受到限制，因此，并未對湖羊瘤胃中微生物區系造成預期的影響。此外，nisin對育肥湖羊瘤胃發酵及菌群結構的影響也可能與試驗動物品種、試驗周期的長短等不同有關，后續還需更多體內試驗對nisin的有效性進行驗證。

3.2 不同日糧蛋白源對育肥湖羊屠宰性能及瘤胃發酵參數的影響

本研究發現，使用DDGS替代豆粕作為日糧蛋白源對育肥湖羊的屠宰性能沒有顯著影響，與前期飼養試驗生長性能結果相一致[10]。Huls等[26]報道稱，使用與本研究相同劑量的DDGS(20%)替代豆粕飼喂育肥綿羊也未對動物生長性能產生影響。Felix等[27]此前的一項研究表明，日糧添加20% DDGS并不會影響羔羊的生長性能，但是當添加劑量達到40%和60%時，羔羊的生長性能降低。據上述結果推測，DDGS的添加水平可能是導致DDGS對育肥綿羊生長性能產生差異的主要原因。

本研究發現，DDGS替代豆粕作為日糧蛋白源導致育肥期湖羊瘤胃中乙酸濃度顯著降低，但丙酸濃度基本不變，此結果與本課題組之前所報道的結果相似[10]。淀粉會在瘤胃嗜淀粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)、棲瘤胃桿菌(Bacteroidesruminicola)等細菌的作用下迅速水解為麥芽糖和葡萄糖，進而發酵轉化為丙酮酸，隨后丙酮酸再分別轉化為宿主可吸收利用的乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸[7]，但是DDGS中的淀粉大多數在工業生產過程中被轉化為了酒精。本研究中，DDGS基礎日糧中玉米粉料含量低于豆粕基礎日糧，這可能是導致飼喂DDGS的湖羊瘤胃中VFA濃度降低的主要原因。此前，Benchaar等[28]也發現，當DDGS的飼喂量從DM的0%增加到30%時，奶牛瘤胃中總VFA含量從99.3 mmol·L-1線性下降到91.1 mmol·L-1。本研究還發現，飼喂DDGS的湖羊瘤胃中氨態氮濃度顯著低于飼喂豆粕湖羊，這可能歸因于豆粕中蛋白質比DDGS中蛋白質更易消化。DDGS與豆粕相比含有較高的過瘤胃蛋白，更低的瘤胃可降解性會導致肽降解以及氨基酸脫氨基作用減少，進而減少氨態氮在瘤胃內的生成[28]。BCVFA主要來源于氨基酸的脫氨基作用[22]，本研究中BCVFA濃度降低也證實了這一觀點。

3.3 不同日糧蛋白源對育肥湖羊瘤胃微生物的影響

本研究發現，DDGS替代豆粕作為日糧蛋白源后導致瘤胃中原蟲以及C.aminophilum的數量顯著降低。原蟲是瘤胃中重要的脫氨基產氨微生物，主要通過吞噬細菌以獲得氮源進而合成自身氨基酸[29]。有研究發現，瘤胃中原蟲被去除后氨態氮濃度下降了26%，這可能歸因于缺少原蟲的情況下菌體蛋白以及飼料蛋白在瘤胃中可降解性降低[29]。瘤胃中高效產氨菌是一類具有極強氨基酸脫氨基活性和特異性的細菌，其數量雖少卻占瘤胃總產氨能力的35%～50%[30]。C.aminophilum與C.sticklandii是由Paster等[31]于1988年從奶牛瘤胃中首先分離出的革蘭陽性高效產氨菌。在本研究中，C.aminophilum的數量顯著降低，其與原蟲數量的降低可能是導致飼喂DDGS的湖羊瘤胃中氨態氮濃度降低的主要原因。有研究者在去除瘤胃原蟲的反芻動物中觀察到瘤胃VFA濃度降低，證明原蟲在瘤胃內飼料降解以及VFA生成中發揮重要作用[29]，這也與本研究中飼喂DDGS的湖羊瘤胃中原蟲數量降低且總VFA濃度下降的結果相符合。

前人研究發現，使用19.5%或20%的DDGS替代豆粕作為肉牛日糧蛋白源并不會顯著影響瘤胃細菌多樣性及組成[11-12]，與本課題組前期在湖羊上的研究結果相一致。而Ramirez等[13, 32]發現，當日糧中DDGS的添加比例增加到DM基礎的30%和50%時，瘤胃細菌的結構發生了顯著變化，這說明日糧添加過高劑量的DDGS對瘤胃細菌可能會產生較大影響。本研究中各處理組優勢菌門均為Bacteroidetes和Firmicutes，二者占總瘤胃細菌菌群的94.47%～96.13%，DDGS替代豆粕作為日糧蛋白源并未改變湖羊瘤胃細菌菌群門水平相對豐度。本研究發現使用DDGS替代豆粕作為蛋白源在湖羊瘤胃細菌屬水平上對RuminococcaceaeUCG-005、Butyrivibrio、Pseudobutyrivibrio和Roseburia產生了顯著影響。此前，本課題組的飼養試驗發現,DDGS替代豆粕后增加了日糧中的粗脂肪含量[10]，而玉米DDGS原料粗脂肪中不飽和脂肪酸比例高，易氧化變質，對動物健康及畜產品品質造成不利影響[33]。前人研究表明，不飽和脂肪酸濃度升高會對瘤胃內微生物造成更大壓力[34]，因此推測，Butyrivibrio2和RuminococcaceaeUCG-005可能對瘤胃中不飽和脂肪酸更為敏感，導致其相對豐度顯著降低。此外，有報道稱，Roseburia是一種可凈利用乙酸的糖酵解菌[35]，本研究中，其相對豐度顯著升高可能與飼喂DDGS的湖羊瘤胃中的乙酸濃度變化相關。此外，DDGS由于其本身營養物質豐富，儲存過程中如果受潮容易滋生霉菌，產生多種霉菌毒素(如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，煙曲霉毒素及玉米赤霉烯酮等)[36]，本研究中瘤胃細菌相對豐度的變化也可能與DDGS原料中霉菌毒素的含量相關。雖然不同日糧蛋白源如何影響瘤胃微生物代謝的機制尚不明確，但隨著宏基因組、宏轉錄組及代謝組等技術的發展，也為未來這種代謝機制的揭示提供了有效手段。

4 結 論

使用DDGS作為日糧蛋白源改變了湖羊瘤胃發酵參數及微生物菌群結構，瘤胃中原蟲以及高效產氨菌數量的降低可能是導致瘤胃內氨態氮濃度降低的主要原因。日糧添加30.5 mg·kg-1DM的nisin對育肥湖羊瘤胃發酵參數及微生物菌群結構均無顯著影響。