中國部分地區犬源偽中間葡萄球菌的流行特征分析

張海霞，張振彪，代禾根，宋 昱，李 蕾，夏兆飛

(中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

偽中間葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)是一種2005年由Devriese等[1]命名的凝固酶陽性葡萄球菌，在此之前歸為中間型葡萄球菌(Staphylococcusintermedius)[2]。偽中間葡萄球菌是一種共生菌，最常定植于健康犬的肛周和鼻腔[3]；同時，也是一種致病菌，可引發膿皮病、外耳道炎、術后創口感染、尿路感染以及其他部位感染[4-8]。由于人與寵物之間的密切接觸，該菌也可在人體定植并引發疾病，目前已有多篇關于人感染偽中間葡萄球菌的報道[9-11]，因此偽中間葡萄球菌對人類健康和公共衛生也具有一定的威脅[12]。

隨著抗生素濫用現象日益嚴重，繼耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)之后，耐甲氧西林偽中間葡萄球菌(MRSP)感染已成為獸醫領域中嚴重威脅動物健康的新興問題[3, 13]，且MRSP被認為是葡萄球菌中耐藥基因的重要“儲存庫”。因此，調查偽中間葡萄球菌的流行特征至關重要。目前國內獸醫臨床中關于偽中間葡萄球菌的報道較為少見，國外的相關研究主要聚焦于MRSP，因此，關于甲氧西林敏感偽中間葡萄球菌(MSSP)的研究在國內外均少見。本研究針對國內部分地區犬源偽中間葡萄球菌(包括MRSP和MSSP)臨床分離株的耐藥性和分子流行特征進行調查，以了解國內偽中間葡萄球菌的感染現狀，為指導臨床監測和合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和細菌分離

2017年11月—2019年4月，共收集601份送檢至中國農業大學動物醫院檢驗科和第三方檢測機構的犬源臨床樣本，接種于5%綿羊血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和甘露醇氯化鈉瓊脂平板中，37 ℃恒溫培養24 h，觀察菌落形態特征，初步篩選出葡萄球菌。

1.2 細菌鑒定

使用Magen HiPure Bacterial DNA試劑盒提取制備細菌DNA模板，貯存于-20 ℃備用。使用16S rDNA基因通用引物進行PCR擴增，將擴增產物進行測序，并將所獲序列在NCBI網站上進行BLAST比對，鑒定細菌種屬(相似性>99%)。

1.3 藥物敏感性試驗

依據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)標準，選用10類共14種抗生素。苯唑西林、青霉素、萬古霉素、克林霉素、阿米卡星、慶大霉素、利福平、多西環素、氯霉素和阿奇霉素購自中國食品藥品檢定研究院；氟苯尼考、恩諾沙星和環丙沙星購自北京索萊寶科技有限公司；利奈唑胺購自上海源葉生物科技有限公司。采用瓊脂稀釋法進行藥物敏感性試驗，測定最小抑菌濃度(MIC)。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213。藥敏結果判定標準參照CLSI VET08和CLSI 2018 M100。對3類及3類以上藥物產生耐藥定義為多重耐藥(MDR)[14]。

1.4 全基因組測序

將“1.2”中提取的細菌DNA模板送至安諾優達公司進行文庫構建及全基因組測序(Illumina HiSeq X Ten平臺)。所獲取的全基因組序列使用Unicycler v0.3.0進行拼接，并與偽中間葡萄球菌MLST數據庫進行比對，獲得各菌株多位點序列分型(ST)，未知ST型由MLST數據庫管理者(vincent.perreten@vbi.unibe.ch)分配ST編號；與ResFinder 2.1和SCCmecFinder v.1.2(www.genomicepidemiology.org)數據庫進行比對，獲得各菌株耐藥基因和SCCmec分型，攜帶mecA基因的偽中間葡萄球菌即為MRSP[15]。使用Harvest軟件包中Parsnp工具對本研究中的所有MRSP和MSSP基因組進行核心基因組進化樹構建，并使用iTOL(www.itol.embl.de)進行標記和可視化。

1.5 統計分析

采用R 4.0.2軟件進行χ2檢驗和Fisher精確檢驗，以P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 偽中間葡萄球菌分離鑒定

經甘露醇氯化鈉瓊脂培養基篩選葡萄球菌，可見平板中生長呈灰白色、表面濕潤、光滑和突起的中等圓形菌落(圖1)。使用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得目的條帶為1 465 bp的PCR產物(圖2)。將PCR產物測序拼接后，在NCBI數據庫中進行BLAST比對，與偽中間葡萄球菌的序列相似性達99%～100%。

圖1 葡萄球菌在甘露醇氯化鈉培養上的生長形態

1～7.PCR產物；8.陰性對照; M.DNA相對分子質量標準

2.2 細菌來源和動物特征

本研究共采集601份犬源性臨床樣本，分離鑒定獲得75株偽中間葡萄球菌，其中42株MRSP(56%，n=42)，33株MSSP(44%，n=33)。偽中間葡萄球菌的分離率為12.5%(n=75)，MRSP的分離率為7.0%(n=42)，MSSP的分離率為5.5%(n=33)。菌株來源見圖3，包括皮膚(42.67%，n=32)、耳道(10.67%，n=8)、尿液(18.67%，n=14)、骨骼(4%，n=3)、鼻腔(2.67%，n=2)、膿腫(2.67%，n=2)、咽拭子(2.67%，n=2)、創口(2.67%，n=2)和其他部位(4%，n=3)，7株(9.33%)來源未知。樣本來源覆蓋18個地區，包括廣東省(n=24)、遼寧省(n=9)、上海市(n=7)、天津市(n=7)、湖南省(n=5)、重慶市(n=3)、浙江省(n=3)、河南省(n=3)、江蘇省(n=3)、山東省(n=2)、四川省(n=2)、福建省(n=1)、河北省(n=1)、湖北省(n=1)、江西省(n=1)、內蒙古自治區(n=1)、寧夏回族自治區(n=1)和安徽省(n=1)。

圖3 不同感染部位分離偽中間葡萄球菌的數量

2.3 耐藥表型

75株偽中間葡萄球菌對青霉素、阿奇霉素、克林霉素、多西環素、環丙沙星、恩諾沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐藥，耐藥率介于49.3%～89.3%；對氟苯尼考和慶大霉素較敏感；對利奈唑胺、萬古霉素、阿米卡星和利福平敏感(表1)。75株偽中間葡萄球菌的多重耐藥率高達90.7%(68/75)。MRSP針對7種抗菌藥物的耐藥率與MSSP相比差異顯著(P<0.05)(表1)。MRSP對青霉素、克林霉素和阿奇霉素的耐藥率高達100%(42/42)；對苯唑西林、環丙沙星、恩諾沙星和多西環素的耐藥率均達到80%以上。42株MRSP均具有多重耐藥性，至少對5種以上受試藥物耐藥，多重耐藥率高達100%(42/42)(圖4)。33株MSSP中，2株對所有受試藥物均敏感，26株至少對3種以上受試藥物耐藥，多重耐藥率為78.8%(26/33)。MRSP與MSSP的多重耐藥率之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 偽中間葡萄球菌中多藥耐藥菌株分布

表1 75株偽中間葡萄球菌對14種抗菌藥物的耐藥率

2.4 耐藥基因

WGS分析結果顯示，75株偽中間葡萄球菌共攜帶19種耐藥基因(表2)。其中，blaZ和aac(6′)-aph(2″)檢出率最高，均為92.0%(69/75)；其次為erm(B)、tet(M)、dfrG、aph(3′)-Ⅲ、ant(6)-Ia和mecA。ant(9)-Ia、erm(A)、fosB和lnu(G)各檢出1株，未檢出erm(C)。在42株MRSP中，blaZ和erm(B)檢出率高達100%，與耐藥表型完全相符；aac(6′)-aph(2″)的檢出率為100%，但慶大霉素耐藥率僅為7.1%。7株含有對截短側耳素類-林可胺類-鏈陽菌素A類耐藥的多藥耐藥基因lsa(E)。MRSP中8種耐藥基因的檢出率與MSSP之間存在顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 75株偽中間葡萄球菌耐藥基因檢出率

2.5 分子分型

75株偽中間葡萄球菌中，共發現70種ST型，54種為新ST型，無優勢ST型。MRSP中存在38種ST型，MSSP中存在33種ST型。對75株偽中間葡萄球菌進行SNP分析，并建立系統發育進化樹(圖5)，結果可見所有菌株彼此的親緣關系并不緊密。

圖5 76株偽中間葡萄球菌的系統發育進化樹(含標準菌株ED99)

42株MRSP中，葡萄球菌染色體基因盒(SCCmec)V 型23株，占54.7%；SCCmecⅢ型2株，占4.8%；SCCmecIV型2株，占4.8%；15株未分型，占35.7%。

3 討 論

本研究中，偽中間葡萄球菌和MRSP的分離率分別為12.5%和7.0%，均低于國內相關的報道[6, 16]。2007年，Sasaki等[17]報道日本犬MRSP的分離率為29.8%。2020年，韓國和德國報道偽中間葡萄球菌的分離率分別為68%[18]和39.6%[19]。本研究中，56%偽中間葡萄球菌為MRSP，高于Feng等(42.7%)[16]和Wang等(44.0%)[6]之前的報道，但低于日本的相關報道(66.5%)[20]。在美國和歐洲，MRSP在偽中間葡萄球菌中的占比相對較低，介于2.5%～33.0%[21-24]。本研究顯示偽中間葡萄球菌分離株主要來源于皮膚、尿液和耳道，與國外的研究具有一致性[21-22]。因采樣部位、物種、試驗設計、地域分布和動物健康狀態的影響，不同研究之間的結果會有所不同，但是國內MRSP的高流行率必須予以重視。

Lee和Yang[18]報道MRSP的多重耐藥率是MSSP的2倍～3倍，而在本研究中MRSP的多重耐藥率是100%，MSSP的多重耐藥率是78.8%，這表明MSSP中存在的多重耐藥現象，這一結果與關珊[25]關于北京地區寵物犬外傷感染中分離到的偽中間葡萄球菌的耐藥性一致，提示臨床獸醫在使用抗生素之前應盡量先采樣進行細菌培養藥敏試驗，以更為合理地使用抗生素。所有菌株均對青霉素呈現高度耐藥，因此不建議將青霉素作為偽中間葡萄球菌感染的常規用藥。2020年，Haenni等[26]關于歐洲MSSP的研究發現，MSSP通常對四環素類、大環內酯類和氨基糖苷類耐藥，這與本研究結果一致。值得注意的是，Wang等[6]的報道中發現所有MRSP均對氟苯尼考敏感，周傳鐸等[27]的研究也與該研究結果一致，但本研究中發現MRSP和MSSP中均存在氟苯尼考耐藥現象。

本研究中，42株偽中間葡萄球菌攜帶mecA，同時所有MRSP均攜帶耐藥基因blaZ、aac(6′)-aph(2″)和erm(B)。耐藥基因blaZ和erm(B)的檢出率高于國內相關研究[6, 16]。42株MRSP中，5株未表現出苯唑西林耐藥，耐藥表型和耐藥基因不一致的情況還需要進一步研究[28]。在7種耐藥基因[ant(6)-Ia、aph(3′)-Ⅲ、lnu(B)、tet(K)、lsa(E)、cat(pC221)和fexA]的檢出率方面，MRSP和MSSP之間未存在顯著差異，提示MSSP中也存在嚴重的基因轉移。

國外的一項回顧性綜述中[29]指出，MRSP的優勢ST型是ST71，隨后依次是ST45、ST258、ST261、ST112、ST265、ST68、ST169和ST181。2012年，Wang等[6]報道ST71是中國北部地區的優勢ST型；Feng等[16]報道ST4、ST5和ST95是華南地區的優勢ST型。在本研究中，MRSP和MSSP中均未發現優勢ST型，說明國內部分地區犬源偽中間葡萄球菌具有較大的遺傳多樣性和個體差異性。國內外的文獻報道顯示在我國華南地區[16]、韓國[18]和美國[30]，MRSP主要為SCCmecV型，與本研究的結果一致。

4 結 論

從國內18個地區分離到的75株犬源偽中間葡萄球菌中存在嚴重的多重耐藥現象，尤其是MSSP的耐藥現狀不容忽視；耐藥基因分布廣泛，且檢出率高；ST型復雜多樣，發現大量的新ST型，且無優勢ST型，提示MRSP和MSSP中均存在較大的遺傳多樣性。因此，加強寵物臨床細菌耐藥性監測，規范診療程序，推動抗生素的合理使用至關重要。