多黏菌素耐藥性研究進展

李立，葉璟，胡蕾，談林華

(浙江大學醫學院附屬兒童醫院外科重癥監護室 國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心，杭州 310052)

多重耐藥菌不斷泛濫已在全世界引起很高的發病率和死亡率，成為現代醫學亟待解決的重大問題。根據預測，到2050年每年將有約1 000萬人死于耐藥菌感染[1]。特別是耐碳青霉烯的腸桿菌科細菌，銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的暴發給抗菌藥物的選擇帶來巨大挑戰[2]。由于缺乏新的有效治療藥物，多黏菌素再次成為治療多重耐藥性的革蘭陰性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染的最后一道防線[3]。

多黏菌素是由廣泛分布于土壤的多黏芽孢桿菌產生的一種聚陽離子多肽[4]，屬于多黏菌素類抗生素，具有親水和親脂的雙親性。根據多黏菌素化學結構的不同可分為多黏菌素A、B、C、D和E五個家族成員[5]。目前在臨床上使用的僅為多黏菌素B和多黏菌素E(即黏菌素)兩種。但隨著多黏菌素的應用，其耐藥菌株在世界范圍內迅速出現[6]。Touati等[7]對北非黏菌素耐藥流行病學進行系統的評價發現，這些耐藥菌株廣泛分布于農場動物的糞便、食物、環境樣本及臨床中。現對多黏菌素耐藥性的研究進展予以綜述，以期為應對多黏菌素耐藥性傳播提供新視角。

1 多黏菌素抗菌作用機制

GNB的外膜是維持細胞穩態的重要屏障。外膜表面脂多糖的存在限制了其疏水性和(或)大分子抗生素的滲透，對細菌起到保護作用。脂質A是脂多糖的重要組成部分，在細菌滲透性及與細胞外部交換中起重要作用[8]。多黏菌素帶正電荷的二氨基丁酸殘基通過靜電作用與GNB外膜中脂多糖脂質A上帶負電的磷酸基團競爭性置換脂多糖上的二價陽離子(Ca2+和Mg2+)，破壞脂多糖的三維結構，進而破壞GNB的細胞膜完整性，導致細胞內容物釋放，引起細菌死亡。多黏菌素還可通過囊泡接觸途徑、羥自由基途徑抑制細菌呼吸酶活性等機制起到殺菌作用[9-11]。

2 多黏菌素耐藥機制

2.1染色體介導的黏菌素耐藥性 GNB對多黏菌素耐藥的機制較復雜，目前仍不明確[3]。脂多糖是多黏菌素的作用靶點，脂多糖的修飾改變會影響其對GNB的殺菌效果。通過陽離子基團4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(4-amino-4-deoxy-L-arabinose,L-Ara4N)和(或)磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PEtN)部分取代脂質A的磷酸基團可以實現對脂多糖的修飾[10-11]。脂多糖修飾的過程受雙組分調控系統調節[12]。該調控系統及其調節器的突變會導致脂質A的磷酸基團被L-Ara4N、PetN陽離子基團取代，降低外膜的負電荷，阻礙多黏菌素與細菌的結合，減弱多黏菌素的殺菌作用[13]。GNB主要通過降低外膜的負電荷來實現對脂多糖的修飾作用，脂多糖的修飾涉及的基因和操縱子如下。

2.1.1pmrCAB操縱子、pmrHFIJKLM操縱子及pmrE基因 pmrCAB操縱子編碼3種蛋白質：PEtN磷酸轉移酶PmrC(又稱eptA)，負責將pEtN基團添加到脂多糖上，因此PmrC過表達會影響多黏菌素與細菌外膜的結合，是黏菌素耐藥性的主要原因之一；響應調節器PmrA(也稱為BasR)；傳感器激酶蛋白PmrB(也稱為BasS)[14]。pmrCAB的突變可能會影響相關蛋白的表達，改變其對多黏菌的耐藥性。有學者通過Sanger測序研究發現，pmrCAB中突變數量最高的是PmrB，其最常見的氨基酸變異是A138T，約占分離菌株的41%；而PmrC的突變是I42V和L150F[15]。Oikonomou等[16]研究發現，黏菌素敏感和耐藥菌株中均存在pmrCAB的突變，表明鮑曼不動桿菌對多黏菌素耐藥機制復雜，僅pmrCAB基因的突變不足以誘導其對多黏菌素的耐藥性。pmrHFIJKLM操縱子(也稱為arnBCADTEF或pbgPE操縱子)和pmrE基因負責陽離子基團L-Ara4N的合成并將其固定到脂質A上[17]。

2.1.2PmrAB雙組分系統及crrAB操縱子 該系統編碼調節蛋白PmrA和蛋白激酶PmrB兩種蛋白，PmrB是一種具有酪氨酸激酶活性的蛋白質，具有傳感器特性，可以檢測細胞膜Mg2+和Ca2+含量的變化、pH值改變及黏菌素等環境信號的變化[18]。受這些環境刺激，PmrB可通過磷酸化途徑激活PmrA，活化的PmrA可依次激活pmrCAB操縱子、pmrHFIJKLM操縱子以及pmrE基因。pmrHFIJKLM操縱子和pmrE基因負責L-Ara4N和pEtN部分的合成及其與脂質A的結合[17]。

crrAB操縱子編碼調控蛋白CrrA和傳感器蛋白激酶CrrB兩種蛋白。crrAB操縱子的生理作用機制仍不清楚。但crrB基因失活可導致pmrAB操縱子過表達，從而引起pmrHFIJKLM操縱子、pmrC和pmrE基因的激活，產生L-Ara4N和pEtN[19]。

2.1.3PhoPQ雙組分系統及其調控基因mgrB 與PmrAB系統類似，環境刺激物(如巨噬細胞吞噬體、Fe2+、Al3+和pH值)可激活具有酪氨酸激酶活性的PhoQ，活化的PhoQ可通過磷酸化途徑激活轉錄調節因子PhoP[20]。活化的PhoP驅動pmrHFIJKLM操縱子的轉錄，該操縱子通過向脂多糖中添加L-Ara4N參與脂多糖的化學修飾。同時，活化的PhoP還可以激活pmrA基因，從而觸發PmrA蛋白的表達，將pEtN添加到脂多糖中[21-22]。

mgrB基因是一個長度為141個核苷酸保守基因，編碼一個47個氨基酸的蛋白質MgrB[21]。該蛋白質對PhoPQ調節系統產生負反饋，降低其對黏菌素的耐藥性。然而mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操縱子的過表達，導致pmrHFIJKLM操縱子激活，引起L-Ara4N生物合成，增加其對黏菌素耐藥性[23]。mgrB基因突變是臨床肺炎克雷伯菌耐藥的主要原因，該耐藥性是通過插入序列(IS5-like、IS1F、ISKpn13、ISKpn14、IS10R)或點突變實現[24]。

2.1.4lpxA、lpxC和lpxD基因 lpxA、lpxC和lpxD基因與脂質A生物合成有關，其突變失活會引起脂多糖合成障礙，導致多黏菌素的作用靶點喪失[25]。這組獨特的基因存在于鮑曼不動桿菌，其突變會影響脂質A的生物合成，形成鮑曼不動桿菌對多黏菌素的高度耐藥性。一項對21株體外培養的多黏菌素耐藥性鮑曼不動桿菌獨立型菌株ATCC 19606的分析表明，脂質A生物合成的3種基因(lpxA、lpxC、lpxD)均含有獨特突變方式：單個堿基的改變、大片段的缺失和IS元件的插入[26]。其中IS Aba11和一個新型的IS4家族元件的替換、截斷、移碼或插入失活會導致脂多糖完全喪失，引起多黏菌素耐藥。脂多糖是細菌的一種主要的毒力因子和主要結構成分，這種突變引起細菌結構變化的同時也會引起其毒力下降。上述機制通常會導致耐藥性增加，但傳播率較低。

另外，GNB對黏菌素的耐藥機制還包括外排泵系統的孔蛋白突變和過表達、莢膜多糖的產生、黏菌素滅活酶等[24]。

2.2質粒介導的黏菌素耐藥性 在臨床分離獲得的對多黏菌素具有耐藥性的菌株仍較少。長期以來對多黏菌素耐藥的機制均被歸因于染色體突變，但這種耐藥性不會在細菌間進行傳播，不具備廣泛流行的特點。直到2015年，中國學者在對食用動物大腸埃希菌抗生素耐藥性例行監測時鑒定出第一個質粒介導的黏菌素可移動耐藥基因mcr，命名為mcr-1[27- 28]。

mcr-1是一種PEtN脂質A轉移酶，屬于“YhjW/YjdB/YijP”堿性磷酸酶超家族[29]。目前共發現了22種mcr-1的遺傳變異體[30]，包括mcr-1.1[27]、mcr-1.2[31]，直到mcr-1.22。這些變異體核苷酸和氨基酸具有高度一致性，對黏菌素的耐藥機制也相似[30，32]。mcr-1介導黏菌素耐藥性的機制與GNB固有耐藥機制相同。mcr-1編碼PEtN轉移酶，促使PEtN加入脂多糖的脂質A上，從而增加脂多糖陽離子電荷，降低黏菌素對脂多糖的結合力[27，32-33]。

在國內，mcr-1的存在最早可追溯到20世紀80年代[34]。1970—2014年對雞大腸埃希菌分離株的一項流行病學調查表明，大腸埃希菌mcr-1的攜帶率從2009年的5.2%增加到2014年的30.0%[34]。推測可能與我國此期間多黏菌素在畜牧業中的大量使用有關。而在一些尚未將黏菌素作為生長促進劑使用的國家(如美國及歐洲)食用動物中mcr-1基因的攜帶率較低(0.1%～10%)[35-36]。2017年我國政府做出嚴格禁止黏菌素作為畜牧生產的增長促進劑的決定[37]。

mcr-1已成為大量GNB對多黏菌素耐藥性傳播的一個重要原因[13，17，27]。mcr-1可在不同菌株間傳播，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、阪崎腸桿菌、沙門菌、弗氏檸檬酸桿菌、檸檬酸桿菌、宋內痢疾和莫拉菌[13，38]，也可在農場動物的糞便、食物、環境樣本中廣泛傳播[39]。2020年，mcr-10在細菌Enterobacter roggenkampii的質粒上得到鑒定，目前在GNB中共發現10個不同變異體[40]。已知的mcr基因的變異體見表1。

3 不同細菌的多黏菌素耐藥機制

3.1腸桿菌科 腸桿菌科家族中對多黏菌素耐藥性菌株較多，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、志賀菌屬、腸桿菌屬和檸檬酸桿菌[54-55]，其主要耐藥機制是通過添加陽離子基團L-Ara4N和(或)pEtN來修飾脂多糖實現[11-12]。

肺炎克雷伯菌染色體耐藥機制主要是由mgrB基因介導。mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操縱子過表達，進而激活pmrHFIJKLM操縱子，促進L-Ara4N 生物合成，增加其黏菌素耐藥性[23]。肺炎克雷伯菌另一個多黏菌素耐藥機制是表面陰離子莢膜多糖的過表達[24]，產生的保護性屏障阻礙了多黏菌素與脂質A的結合。

在大腸埃希菌中，mgrR是其對多黏菌素耐藥的遺傳決定因素[56]。mgrR通過將pEtN添加到脂多糖中實現對多黏菌素的耐藥。在沙門菌中，mig-14基因可以通過降低生物體外膜的滲透性，支持生物膜形成來影響多黏菌素耐藥性[57]。而在鼠傷寒沙門菌中，lpxM可以調節脂質A的酰化作用，其失活可導致L-Ara4N修飾缺失，降低多黏菌素的耐藥性。

除上述染色體基因改變外，腸桿菌科細菌是可移動多黏菌素耐藥基因的第一個儲存庫，2015年11月首次在動物來源大腸埃希菌菌株中發現了質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1[27]。迄今為止，大腸埃希菌仍是mcr陽性分離株中最流行的物種，占攜帶mcr分離株總數的90%以上，其次是腸沙門菌(7%)、肺炎克雷伯菌(2%)[58]。截至2019年，mcr在已在全球47個不同國家均有報道，廣泛分布于動物、水、食物和生存環境中[39，58]。

3.2鮑曼不動桿菌 與其他腸桿菌科細菌相比，鮑曼不動桿菌缺乏用于L-Ara4N生物合成所有必需基因[13]。Adams等[59]研究顯示，鮑曼不動桿菌的黏菌素耐藥性與pmrA和pmrB基因有關。pmrA和pmrB基因突變引起pEtN加入脂多糖中，降低外膜的負電荷，阻礙多黏菌素與細菌的結合，產生耐藥性。對黏菌素耐藥的鮑曼不動桿菌菌株也可通過PmrA/B突變下調操縱子PmrCAB表達，降低其耐藥性。

另外，在鮑曼不動桿菌中鑒定出生物素、lpxA、lpxC和lpxD基因與多黏菌素耐藥性關系密切。生物素、lpxA、lpxC和lpxD是脂質代謝的重要輔助因子，生物素水平不足或lpxA、lpxC和lpxD基因突變可影響脂質A的生物合成，是鮑曼不動桿菌中多黏菌素耐藥性相關的因子[3，13]。而較高的生物素水平導致脂質A的產生增加，可降低鮑曼不動桿菌對黏菌素的耐藥水平[60]。另據Bojkovic等[61]研究揭示，LptD是新合成的脂多糖插入到外膜所必要的成分，去除lptD基因可導致鮑曼不動桿菌脂多糖完全缺失，引起多黏菌素耐藥性降低。

對鮑曼不動桿菌，常規染色體編碼多黏菌素耐藥性的傳播力有限。然而，近年在鮑曼不動桿菌中發現了質粒攜帶的mcr基因：在捷克共和國鮑曼不動桿菌中檢測到了mcr-4[62]，在巴基斯坦鮑曼不動桿菌中檢測到了mcr-1[63]以及在中國[52]和巴西[64]等地檢測到mcr-4.3。這種基因型分布和耐藥機制的發現對鮑曼不動桿菌對多黏菌素的耐藥性研究至關重要。

3.3銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌的耐藥性由5個調節脂多糖修飾的雙組分系統介導，除PmrAB和PhoPQ的雙組分系統外，還涉及ColR/ColS、ParR/ParS和CprRS三個雙組分調控系統[24]。在細胞外Zn2+過量的情況下，ColR/ColS雙組分調控系統上調，將PEtN添加到脂質A中，從而引起黏菌素耐藥性[10]。

與鮑曼不動桿菌類似，銅綠假單胞菌中lpxC或lpxO2基因的突變也可導致脂質A的生物合成障礙，使多黏菌素作用靶點丟失，導致對多黏菌素耐藥性增高[3]。此外，在細胞膜Mg2+水平降低的情況下，外膜蛋白OprH(或H1)過表達并與帶負電荷的磷酸基團相結合，阻礙多黏菌素的結合，產生耐藥性[65]。Perez等[65]揭示多黏菌素耐藥性也可能通過產生過多莢膜而發生。

在質粒介導的黏菌素耐藥方面，人們首次在美國馬里蘭州地區銅綠假單胞菌中檢測到mcr。2018年，Snesrud等[66]通過全基因組測序發現了銅綠假單胞菌中編碼mcr-5的染色體中攜帶黏菌素不敏感的轉座子。2019年在對巴基斯坦地區銅綠假單胞菌多黏菌素耐藥性調查中也檢測到mcr-1陽性的分離菌株[64]。銅綠假單胞菌中mcr基因的起源、可傳播性和流行性仍有待進一步鑒定。

4 展 望

GNB是引起臨床感染的常見病原體，如碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌等多重耐藥微生物感染越來越受到人們的關注。新型抗菌藥物研發遲緩，促使黏菌素再次成為人們治療多重耐藥GNB的重要選擇。然而畜牧業和農業中黏菌素的廣泛濫用使其耐藥菌株在世界范圍內出現，這大大損害了黏菌素的功效。特別是質粒攜帶的mcr耐藥基因的跨物種傳播，已成為全世界的公共衛生和臨床管理領域關注的熱點和焦點問題。因此，應加強抗生素耐藥基因的檢測，同時加強相關專家之間的跨學科交流與合作，有效制止黏菌素在農業、畜牧業及臨床上的濫用，嚴格控制細菌耐藥性的進一步傳播，同時制訂政策引導，加大新型抗生素的研發投入力度。