子癇前期動物模型的特點及其局限性

尹祾軒，司延如，曹占鑫，柳新祿，楊濰濰

(濰坊醫學院生命科學與技術學院，山東 濰坊 261053)

子癇前期(preeclampsia，PE)是孕產婦和圍生兒發病和死亡的主要原因，影響著全世界5%～8%的孕產婦[1]。PE不僅影響后代健康狀況，還會導致孕婦生產風險增加，包括高血壓、蛋白尿、糖尿病和新陳代謝紊亂[2]。關于PE的病因和發病機制尚未闡明[3]。目前認為，PE的發病與內皮功能障礙，免疫適應性不平衡，過度炎癥，氧化應激反應增加，血管生成不足和系統性血管收縮異常密切相關[4-5]。但現階段的醫學治療并不能滿足PE患者的需求，因此PE動物模型對于確定病因、開發新的治療方法以及評估干預措施的安全性和有效性至關重要。

一個理想的PE動物模型應該表現出PE患者的癥狀，包括高血壓、蛋白尿、宮內生長受限、內皮功能障礙和血管生成/抗血管生成因子失衡，這些癥狀是由妊娠早期胎盤滋養層細胞浸潤不足導致，并在胎盤分娩后消失。目前，絕大多數PE動物模型是在大鼠和小鼠上進行，這些嚙齒類動物與人類的胎盤類型相同，它們的胎盤表現出間質和血管內滋養層細胞的侵襲以及母體動脈的重塑。現就PE動物模型的特點及其局限性予以綜述，以強調針對科學問題采用適當的動物模型的重要性。

1 血管內皮功能障礙模型

血管內皮功能障礙是PE的典型特征，其中可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)以及內毒素引起的炎癥反應在PE疾病中的作用得到廣泛關注。

1.1sFlt-1模型 近年來，各種PE模型在疾病病理生理機制探究中被應用[6]，這使得研究人員能夠更好地了解PE的病理生理機制，其中在大鼠和小鼠中過表達sFlt-1是PE的重要模型。Maynard等[7]研究證明，給予大鼠尾靜脈輸入外源性sFlt-1，大鼠可產生PE表型，包括高血壓并伴有蛋白尿、腎小球內皮增生，且PE妊娠大鼠血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)的拮抗劑sFlt-1上調。sFlt-1是VEGF受體fms樣酪氨酸激酶1的剪接變體，是VEGF和PIGF有效的拮抗劑，它缺乏跨膜和胞質結構域，由胎盤等許多組織產生，但其生理作用尚不清楚[8]。PE胎盤中sFlt-1信使RNA(messenger RNA，mRNA)上調，這與循環中sFlt-1蛋白的增加有關，且其含量在分娩后48 h內下降[9]。但值得注意的是，sFlt-1的全身性作用不需要存在胎盤，這表明sFlt-1對母體內皮細胞具有直接作用。此外，也有研究提出可以通過胎盤特異性基因操作，如Kumasawa等[10]采用將表達人源性sFlt-1的慢病毒載體轉導至小鼠囊胚，再移植到假孕母鼠體內，通過在小鼠胎盤中特異性表達人源性fms樣酪氨酸激酶1，開發了PE獨特的動物模型。該模型可以觀察到明顯的胎盤血管生成受損和子宮內生長受限。

然而，在某些PE患者體內的sFlt-1表達并不增加，特別是遲發性PE患者。因此，在選擇PE動物模型時需要根據研究目的來選擇合適的動物模型。

1.2NOS抑制模型 PE發病與內皮型NOS表達減少導致的一氧化氮(nitric oxide，NO)失活之間存在很強的相關性，NO由血管內皮細胞產生，既可舒張體內血管平滑肌，又可以有效增加血管有效彈性[11]，在血壓調節中起重要作用。因此，NO缺乏可導致平均動脈壓升高以及血管升壓素的反應敏感性增加[12]。N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)是NOS的非特異性抑制劑，有證據表明L-NAME可以作為大鼠PE綜合征的誘發劑[13]。

Lu等[14]從小鼠妊娠的第13天開始，經飲水給小鼠喂養60 mg/(kg·d)的L-NAME，持續給藥作用至妊娠的第20天，成功構建小鼠PE NOS抑制模型，該模型小鼠出現動脈壓升高，妊娠結束時存活的胎鼠數量減少以及胰島素抵抗明顯增加。同樣L-NAME在大鼠PE模型中使用也較為廣泛，Yallampalli和Garfield[15]對妊娠早期大鼠皮下注射L-NAME，對照大鼠注射相同劑量的硝酸甘油，結果表明，與對照大鼠相比，每天注射25 mg/(kg·d)和50 mg/(kg·d)的L-NAME大鼠收縮壓呈劑量依賴性增加，同時妊娠大鼠出現高血壓、胎鼠發育遲緩等表現，符合PE的臨床癥狀。此外，胎鼠出現了明顯的體重下降，其機制尚未清楚，可能與NO調節子宮胎盤血流量有關[16]。由此可見，對孕鼠注射L-NAME可誘導產生高血壓、蛋白尿、腎功能損傷、胎盤病理、肝功能損傷以及胎鼠發育受限、畸形、自然流產、死胎等，與人類PE表型極為相似[17]。雖然通過長期抑制NOS誘發的PE動物模型有很多可觀的臨床表現，但由于NO高度不穩定，需通過測定NO的代謝產物硝酸鹽或亞硝酸鹽來判斷NO活性[18]，以評估臨床表征的準確性。

1.3低劑量內毒素動物模型 在Faas等[19]的研究中，基于內毒素和PE引起的Shwartzman反應有許多相似的病理生理現象，所以他們提出使用內毒素誘導的妊娠大鼠構建PE動物模型。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁的一種有毒成分，其與PE胎兒生長受限密切相關。1994年，Faas等[19]在大鼠妊娠第14天經頸靜脈插管1 h內滴注LPS，劑量為1.0 μg/kg，其可導致妊娠大鼠胎盤炎癥，繼而出現胎兒流產和胎兒生長受限癥狀，構建了經典的PE大鼠模型。Hu等[20]在SD大鼠妊娠第13天開始腹腔注射LPS，劑量為20 μg/kg，隨后在第14～18天劑量每天增加10 μg/kg，他們認為該劑量是LPS誘導大鼠PE模型的最佳劑量，并通過酶聯免疫吸附測定發現，孕鼠血清腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6等炎癥因子水平升高，胎盤浸潤增加，且出現高血壓、蛋白尿等PE典型癥狀，同時胎鼠有明顯的生長受限與早產癥狀。雖然低劑量內毒素誘導的PE模型構建操作簡單、經濟，但腎病理改變的報道較少。

2 子宮胎盤灌注減少模型

目前，已有多個模型動物闡明缺氧和缺氧再灌注損傷在PE病理生理中的作用[21]。子宮胎盤灌注減少(reduced uteroplacental perfusion，RUPP)在PE發病中起重要作用，因此，建立一種動物模型來模擬PE發病中子宮動脈的灌注壓力和血流量減少非常有必要。Crews等[22]選取妊娠中期(妊娠第14天)的SD大鼠，將銀夾(直徑為0.203 mm)分別放置在大鼠腹主動脈與左、右側卵巢動脈以減少流向子宮胎盤的血液。這種方法可使妊娠大鼠子宮灌注壓降低約40%，同時可引起大鼠高血壓、血管功能障礙、胎盤缺氧，約50%的胎兒丟失且存活胎兒體重減輕；此外體內循環中腫瘤壞死因子-α和sFlt-1水平升高，且VEGF和PIGF水平下降，符合PE的診斷標準。Fushima等[23]在美國癌癥研究所品系中成對繁殖小鼠1～2個月，并在第14.5天時采用異氟烷麻醉妊娠小鼠，結扎卵巢分支血管束和子宮血管束構建RUPP小鼠模型。結果顯示，小鼠血清中的sFlt-1水平升高，出現妊娠期高血壓，蛋白尿排泄增多，胎鼠吸收和生長受限。

RUPP模型是迄今為止可重復性最高的PE嚙齒動物模型[24]。但是在RUPP模型中，腎小球內皮細胞并不出現功能障礙，因此并不能用于對PE腎功能損害的研究。盡管動物RUPP模型體現了許多PE的典型臨床特征，但仍存在一定的局限性，其中最重要的為RUPP模型不能用于研究PE的早期機制，尤其是PE相關的滋養層細胞侵襲，血管重塑以及這些因素引起的免疫反應；此外，為RUPP模型結扎在一定程度上造成流向心臟、胃、腎臟、腸道等器官的血流量減少，影響了心排血量和血流動力學[25]。

3 腎素-血管緊張素系統紊亂模型

在正常妊娠過程中，腎素-血管緊張素系統在蛻膜、胎盤形成和螺旋動脈重構中起重要作用。通過將表達人類血管緊張素雌性小鼠與表達人類腎素雄性小鼠交配可成功建立PE模型。胎盤中人源血管緊張素、人源腎素被分泌到母體循環，這會導致妊娠小鼠在妊娠晚期出現血壓暫時升高、蛋白尿、胎盤壞死、胎鼠體重降低[26]。腎素-血管緊張素系統與血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibodies，AT1-AAs)密切相關，AT1-AAs已被證明能夠特異性地刺激血管緊張素Ⅱ1型受體(一種公認的高血壓介質)。血管緊張素受體與血管緊張素Ⅱ結合導致全身微動脈收縮，動脈血壓升高[27]。AT1-AAs在PE患者的血清中上調，且能夠激活與sFlt-1、內皮素-1上調相關的細胞內級聯反應[28]。Siddiqui等[29]提取PE妊娠婦女800 μg總IgG或AT1-AAs，在小鼠妊娠第13天時經框內注射，結果顯示小鼠也出現腎小球、胎盤的異常表現。雖然此類造模操作較為復雜，但該類模型可為PE與自身免疫性疾病的研究提供有效的實驗工具。

4 基因操控動物模型

PE基因缺陷模型多采用基因打靶技術敲除單個基因，觀察該基因缺陷動物孕期是否會出現PE樣臨床癥狀。該造模方法是以基因操控的方式，調節特定的蛋白表達，從而觀察某一特點基因在PE形成中的作用。

4.1兒茶酚-O-甲基轉移酶(catechol-O-methyl transferase，COMT)模型 PE患者胎盤缺氧會破壞血管生成的平衡，涉及VEGF、PLGF和sFlt-1異常表達，最終導致PE樣臨床癥狀。但是，典型的PE癥狀不僅僅是高表達sFlt-1和低表達PLGF，低水平sFlt-1和高水平PLGF在患者中也可存在。

Parchem等[30]的研究表明，COMT缺陷(Comt-/-)小鼠在妊娠期間表現出PE樣表型。缺乏COMT的妊娠小鼠由于缺乏2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)而表現出高血壓、蛋白尿、腎小球病變等PE表型。同時，Kanasaki等[31]在Comt-/-PE模型中還發現孕鼠出現宮內發育遲緩癥狀，且該模型中孕鼠子宮蛻膜中動脈出現了血栓的情況，而胎盤中迷路層與海綿層中的滋養層細胞和巨滋養層細胞未見異常．也未見滋養層細胞浸潤情況。2-ME由COMT在胎盤中產生，它是雌二醇的天然代謝產物，在懷孕期間水平會升高，重度PE患者胎盤COMT活性受到抑制。2-ME可以改善Comt-/-妊娠小鼠的PE特征，無毒且可抑制胎盤缺氧，抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和sFlt-1的表達。該模型具有許多PE樣臨床癥狀，為研究者探究PE發病與先天遺傳或內分泌代謝異常間的關系提供了一定的研究方向。

4.2胎盤腺苷脫氨酶缺乏模型 胎盤在妊娠中起著多種作用，不僅支持胎兒在子宮中的生長，還可以向胎兒輸送氧氣、營養物質并清除母體內胎兒排泄的廢物[32]，是一種在妊娠期間將母體和胎兒連接起來新形成的器官。此外，胎盤還是一種可以合成、分泌各種激素、神經遞質以及血管活性分子的內分泌器官。腺苷是體內的關鍵信號分子，是機體缺氧時局部產生的調節性物質。但是，某些疾病狀態與腺苷的長期增加相關，因此產生持久性腺苷信號是有害的[33]。以往有文獻報道，孕婦的腺苷水平升高[34]。為了探究過量胎盤腺苷的病理后果，Iriyama等[35]設計了兩種獨立的PE動物模型，一種是僅在胎盤中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠，另一種是病源性自身抗體誘導的PE動物模型。他們在實驗中將雄性Ada-/-/fLi-Tg+與雌性Ada+ /-/fLi-Tg+交配，構建了僅在胎盤中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠——胎盤腺苷脫氨酶缺乏小鼠，結果顯示，與胎盤腺苷脫氨酶陽性小鼠相比，在胚胎的第12.5天，胎盤腺苷脫氨酶缺乏小鼠胎盤中的腺苷水平顯著升高，且在第18.5天繼續升高；同時，腺苷脫氨酶缺乏小鼠平均收縮壓于胚胎的第15.5天開始升高，一直持續至產后第5天；尿蛋白于胚胎的第18.5天升高，一直持續至產后第7天。除上述表現外，該模型小鼠也出現了sFlt-1基因水平升高、母體出現腎臟病理改變以及胎盤重量顯著降低與胎兒生長受限等PE典型癥狀。

該類型模型的建立為進一步探究腺苷及其相關因素在PE發病、發展中的作用提供新的研究方向。

5 小 結

隨著科研人員對PE發生和發展機制認識的提高，至今人們才完全認識這種疾病的異質性，對PE疾病的新認識表明PE的特征可能是由于不同原因引起，由此科研人員嘗試構建各種類型的PE動物模型，這些動物模型為PE的探究和某些致病因素提供了許多理論支持。應當指出的是，許多干預措施可以導致動物引起妊娠期高血壓、蛋白尿等PE樣臨床癥狀。雖然PE的動物模型多種多樣，但也各有其優缺點，且它們的重復性和特性也不相同。同時，PE動物模型由于其發病機制不同而存在自身的局限性，PE是多種因素共同作用產生的緩慢而復雜的過程，動物的胎盤形態、生理特性與人類本質上不同，所以無論哪一種模型均很難完全再現人類的病理過程。因此，研究人員必須了解每種動物模型的特點及局限性，以確保在探究疾病的同時能夠選擇最佳模型來解決適當的科學研究問題。在目前的情況下，根據研究的需要，可以在必要時采取多種建模方法以期更接近人類PE動物模型，從而為探索PE的發病機制以及預防和治療提供新思路。