阿爾茨海默病腸道菌群相對豐度與認知功能的關系

王旭，馬素亞，周夢玲，李晨萌，魏明清，倪敬年，李婷，田金洲，時晶

(北京中醫藥大學東直門醫院腦病三科，北京 100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種復雜、進行性、不可逆轉的神經退行性疾病[1]，表現為以記憶力減退為主的多領域認知功能損害[2]。全世界超過5 000萬人患有AD[3]，占所有癡呆病例的60%～80%[4]。AD的發病機制復雜，相關假說包括β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)假說、Tau蛋白假說、神經免疫假說、氧化應激假說等[5-6]。近年研究表明，許多神經退行性疾病的發病機制可能與腸道菌群有關。胃腸道的共生菌群可通過腸-腦軸調節神經炎癥以及中樞神經系統自身免疫[7]，有研究者在AD大腦中觀察到抗炎細菌菌群的減少和促炎細菌菌群的增多[8]。同時，腸道菌群還可能通過觸發代謝性疾病引起癡呆，研究表明，糖尿病和肥胖等代謝性疾病會增加AD的發生風險，而腸道菌群的代謝改變可引起機體的代謝異常[9]。因此，進一步了解腸道微生物的多樣性，分析其與AD發生的關聯性，對有關AD的臨床危險因素和發病機制的研究具有推動作用，可為尋找有效干預手段提供一定參考[10]。本研究旨在探討AD患者腸道菌群相對豐度與認知功能的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2019年5月北京中醫藥大學東直門醫院腦病三科門診、病房及社區招募的61例受試者作為研究對象，年齡52～91歲；根據診斷標準分為正常對照(normal control，NC)組(21例)、遺忘型輕度認知損害(amnestic mild cognitive impairment，aMCI)組(20例)、AD組(20例)。

1.1.1納入標準 NC組采用美國梅奧診所認知正常診斷標準[11]：①無記憶減退或其他認知損害主訴，或有不穩定的輕微記憶減退；②無記憶損害客觀證據；③無活躍的神經或精神疾病及其他可能影響認知功能的疾?。虎芪词褂镁袼幬?；⑤簡易精神狀態檢查表(mini-mental state examination，MMSE)得分大學>26分、中學>24分、小學>23分、文盲>22分[12]；⑥臨床癡呆評定量表(clinical dementia rating，CDR)評分為0分[13]。

aMCI組采用歐洲阿爾茨海默病協會的輕度認知損害診斷標準[14]：①受試者或其照料者有認知功能下降主訴；②客觀的記憶障礙，延遲故事回憶(delayed story recall，DSR)量表評分<12.5分；③總體認知功能正常，MMSE得分大學>26分、中學>24分、小學>23分、文盲>22分[12]；④臨床評估證實存在認知障礙；⑤CDR評分為0.5分，記憶領域評分為0.5分；⑥日常生活能力正?；騼H有輕微損害；⑦無癡呆，不符合美國國立神經病學語言障礙卒中研究所和AD及相關疾病協會的AD標準[15]；⑧Hachinski缺血量表評分≤4分[16]；⑨漢密爾頓抑郁量表評分<12分[17]；⑩沒有內側顳葉萎縮(包括海馬體積萎縮)。

AD組采用國家衰老研究所-美國阿爾茨海默病學會[2]很可能的AD癡呆核心臨床標準：①起病隱匿，認知功能逐漸惡化達數月或數年；②情景記憶和至少一個其他認知領域的顯著損害；③MMSE得分大學≤26分、中學≤24分、小學≤23、文盲≤22分[12]；④日常生活能力受損[日常生活能力量表(activities of daily living scale，ADL)評分≥16分][18]；⑤Hachinski缺血量表評分≤4分；⑥內側顳葉萎縮；⑦有足夠的聽力和視力配合臨床研究，有一定的文化程度，既往能夠閱讀簡單的文章和書寫簡單的句子。

1.1.2排除標準 ①其他神經變性疾病，包括帕金森病、血管性癡呆、亨廷頓病、正常壓力腦積水、腦腫瘤、進行性核上性麻痹、癲癇、慢性硬膜下血腫及多發性硬化；②有嚴重頭腦外傷史伴有持續神經功能缺損或已知的腦結構異常；③嚴重的腦血管疾病及肝臟、腎臟、肺部、代謝性或內分泌系統疾病(如甲狀腺功能異常)；④抑郁狀態(漢密爾頓抑郁量表評分≥12分)，或其他精神障礙；⑤有顯著的維生素B12或葉酸缺乏；⑥有癲癇病史或嚴重的藥物或乙醇濫用病史；⑦1個月內服用過抗生素；⑧1個內服用過胃腸動力藥、瀉藥或其他影響胃腸動力的藥物；⑨1個內服用過益生菌等影響腸道菌群的藥物；⑩有嚴重的神經功能缺損以至于不能完成相關檢查，如便利手偏癱、各種失語、視聽障礙等。

1.2方法 采用MMSE評估受試者總體認知功能，CDR評定認知損害的程度，ADL評估日常生活能力，DSR評估情景記憶。

對所有受試者進行培訓，指導其按照同樣的步驟使用一次性便盒采集糞便樣品約10 g，迅速置于4 ℃冰箱內冷藏，并于24 h內將樣品置于-80 ℃冰箱保存。采用TIANamp糞便提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取糞便中菌群的DNA，用于16S核糖體RNA高通量測序。對獲得的DNA進行文庫質檢合格后，用16S特定引物對特異可變區V4區域進行擴增。使用Illuminam MiSeq平臺進行細菌16S核糖體RNA高通量測序。得到有效序列數據后，使用Mothur v1.34.4在97%相似水平下對所有序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)歸類。根據OTU歸類結果對細菌物種間的親緣關系和物種間的差異進行分析，獲得細菌分類和細菌相對豐度。

2 結 果

2.13組一般資料比較 3組受試者的性別、年齡、受教育年限、體質指數比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組受試者的一般資料比較

2.23組認知功能比較 3組受試者的MMSE、DSR、ADL、CDR評分比較差異有統計學意義(P<0.01)，AD組的MMSE、DSR評分均低于NC組和aMCI組，ADL、CDR評分均高于NC組和aMCI組(P<0.05)；aMCI組的DSR評分低于NC組(P<0.01)，CDR評分高于NC組(P<0.01)，aMCI組與NC組的MMSE、ADL評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.33組差異腸道菌群相對豐度比較 3組受試者的擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目相對豐度比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組受試者的厚壁菌門、β變形菌綱、梭菌綱、伯克菌目、梭菌目、產堿桿菌科、梭菌科、薩特菌屬相對豐度比較差異有統計學意義(P<0.05)。AD組的β變形菌綱、伯克菌目、產堿桿菌科、薩特菌屬相對豐度均高于NC組(P<0.05)，厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對豐度低于NC組(P<0.05)；aMCI組的產堿桿菌科、薩特菌屬相對豐度高于NC組(P<0.05)，厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目相對豐度低于NC組(P<0.05)，aMCI組與NC組的β變形菌綱、伯克菌目、梭菌科相對豐度比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD組與aMCI組的差異腸道菌群相對豐度比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 3組受試者的認知功能比較 [分，M(P25，P75)]

2.4差異腸道菌群相對豐度與認知功能的相關性 將上述差異菌群的相對豐度與認知功能測試分數進行相關性分析，結果顯示，不同分類水平上厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對豐度與MMSE評分呈正相關(P<0.05)，β變形菌綱、伯克菌目、產堿桿菌科、薩特菌屬相對豐度與MMSE評分呈負相關(P<0.05)；不同分類水平上厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、梭菌科相對豐度與DSR評分呈正相關(P<0.05)，β變形菌綱、伯克菌目、產堿桿菌科、薩特菌屬相對豐度與DSR評分呈負相關(P<0.05)。見表4。

3 討 論

人體內定居著大量的微生物，據估計，人體內存在500～1 000種細菌[19]，其中大部分定居在腸道[20]。腸道菌群通過免疫、循環和神經途徑調節中樞神經系統的發育和穩態，反過來，中樞神經系統通過應激和內分泌反應塑造腸道微生物群落，這種腸-腦軸的雙向作用可能與復雜的中樞神經系統疾病有關[21]。腸道菌群導致AD的機制可能始于腸道微生物群失調、局部和全身炎癥的發展以及腸-腦軸的失調，腸上皮屏障通透性的增加導致細菌、病毒及其神經活性產物的侵襲，并引起大腦的神經炎癥反應，進而導致AD[22]。但既往對于AD患者腸道菌群與認知功能關系的研究仍不充分。

表3 3組受試者的差異腸道菌群相對豐度比較

表4 差異腸道菌群相對豐度與認知功能的相關性

擬桿菌門和厚壁菌門是腸道菌群中的兩個優勢細菌門。本研究結果顯示，AD患者擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目增加，aMCI和AD患者的厚壁菌門均減少，且厚壁菌門與MMSE和DSR評分呈正相關，提示人體腸道中擬桿菌門和厚壁菌門菌群的改變可能導致總體認知功能和情景記憶功能的下降，進而促進AD的發生和進展。目前，對于AD患者腸道菌群的研究仍存在爭議。Vogt等[23]研究發現，AD患者的腸道菌群中厚壁菌門減少、擬桿菌門增加；也有研究顯示，AD患者的腸道菌群中擬桿菌門減少[24]。這些研究的樣本量較小，難以得出一致的結論，故需要大樣本的研究提供更為可靠的證據。

人體內的腸道菌群通過產生短鏈脂肪酸對結腸黏膜的結構完整性和代謝功能發揮重要作用，其中乙酸、丙酸和丁酸是腸腔中含量最豐富的短鏈脂肪酸[7]。擬桿菌主要產生乙酸和丙酸鹽，而厚壁菌主要產生丁酸鹽。丁酸鹽是結腸細胞的主要能量來源，已證明其可增加小鼠的胰島素敏感性，并有抗炎作用，且有潛在的“抗肥胖”作用[25]。在糖尿病[26]和肥胖[27]人群中厚壁菌門減少，而糖尿病和肥胖是AD發病的危險因素[28-29]。此外，丁酸鹽還可能通過誘導抗氧化應激、作為組蛋白去乙?；敢种苿┓乐股窠浽劳鯷30]。

有研究顯示，在Aβ寡聚體誘導的AD小鼠腸道菌群中梭菌顯著減少[31]。本研究中AD患者腸道菌群中梭菌綱、梭菌目、梭菌科顯著減少，且相關性分析顯示梭菌相對豐度的減少與情景記憶功能和總體認知水平下降有關。有學者對2型糖尿病患者腸道菌群進行分析，發現梭菌綱顯著降低[26]。也有研究發現，在多發性硬化患者的腸道菌群中梭狀芽孢桿菌ⅪVa和Ⅳ明顯減少甚至耗竭[32]，由于多發性硬化是一種影響大腦和脊髓的自身免疫性疾病，而梭狀芽孢桿菌所生產的丁酸能夠維持結腸上皮穩態并通過誘導結腸調節性T細胞產生抗炎作用，故研究者推測大量產丁酸梭狀芽孢桿菌的缺失與多發性硬化的發病機制有關。因此，作為丁酸的生產者，厚壁菌門及其下屬的梭狀芽孢桿菌可能通過抗炎、抗氧化應激、增加胰島素敏感性等對AD相關的認知功能產生積極影響。

擬桿菌門、變形菌門均屬于革蘭陰性菌，可分泌大量的脂多糖，脂多糖可能作用于白細胞和小膠質細胞Toll樣受體4，促進核因子κB介導的細胞因子產生，從而升高Aβ水平，損害少突膠質細胞和髓鞘，同時，Aβ1～42也是Toll樣受體4的激動劑，可引起Aβ水平升高，形成惡性循環，加重AD進展[33]。伯克菌目是β變形菌綱中的一個目，產堿桿菌科是伯克菌目中的一個科，薩特菌屬是產堿桿菌科的一個屬，與其他變形菌一樣，均屬于革蘭陰性菌。本研究結果顯示，AD組β變形菌綱、伯克菌目、產檢桿菌科、薩特菌屬的相對豐度顯著升高，且與MMSE評分以及DSR評分呈負相關，這可能與其分泌的脂多糖導致認知損害有關。動物實驗顯示，口服益生菌(乳雙歧桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌)可顯著改善老年SAMP8小鼠的記憶缺陷、腦神經元和突觸損傷、膠質細胞活化，并改善腸道和大腦中的菌群組成，同時減輕腸屏障和血腦屏障的破壞，降低血漿和大腦中的脂多糖水平，在信使RNA水平上降低大腦和腸道的炎癥因子水平[34]。

綜上所述，擬桿菌門、厚壁菌門、梭菌綱、變形菌綱及其部分下屬的菌群改變可能導致AD患者認知功能下降，可能促進AD的發生發展。因此，腸道菌群可能成為AD的生物標志物，且可能通過調節腸道菌群來預防和治療疾病。但本研究屬于橫斷面研究，難以得出腸道菌群變化與AD認知功能變化的因果關系，且樣本量較小，可能存在偏倚，需要大樣本、前瞻性研究進一步驗證。