苦木主要生物堿成分的分離及腸道微生物的轉化研究

陳封政，龍 潔，孫國峰，田 沖，李書華※

(1.樂山師范學院 a.化學與資源環境學院 b.樂山特色農產品藥用成分研發工程中心，四川 樂山 614000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000)

0 引言

苦木Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.為苦木科苦木屬植物苦木的干燥枝和葉，是我國民間的常用中草藥，具有消炎、抗菌、解毒等功效[1]，其主要功效成分為三萜、生物堿和苦木內酯等[2]。苦木是消炎利膽片的主要原料藥材，單方藥苦木注射液收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》，主治感冒、上呼吸道感染、腸炎和細菌性痢疾等[3]。目前，研究人員已經從苦木中分離鑒定出18個生物堿成分[4],其主要成分為苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)[5-6]，含量約為干藥材的千分之三[7-8]，該生物堿具有抗炎和治療腸炎的作用[9-10]，與藥材的主治功能一致，是該藥材的特征成分，但是尚無苦木酮在體外或體內的代謝研究。藥物在腸道菌群的作用下發生生物轉化，直接對藥物在體內的生物利用度以及藥物對疾病的治療產生重要影響[11-12]。為了研究苦木特征成分在胃腸道內的變化，我們對苦木的生物堿成分進行了分離鑒定，對藥材中主要特征生物堿成分的含量進行了測定，并研究了特征成分在仿生胃液、腸液中的穩定性與變化情況，為藥材苦木的深入研發奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

苦木(Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.)，購買于安徽亳州中藥材市場，經樂山師范學院成英副教授鑒定為苦木科植物苦木的干燥枝和葉，標本保存于樂山師范學院樂山特色農產品藥用成分研發工程中心(20170901)。

1.2 儀器

旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-2000A)，高速多功能粉碎機(上海塞耐機械有限公司，JY-1000A)，循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司，SHZ-D(Ⅲ))，電子天平(上海越平科學儀器有限公司，FA2004)，烘箱(上海朗軒實驗設備有限公司)，核磁共振譜儀(Bruker，AV 400)。

2 方法與結果

2.1 苦木生物堿成分的提取

稱取苦木藥材10 kg，粉碎，置于塑料桶中，加入95%乙醇，室溫浸泡4天，過濾，得到第一次浸泡液；再次將藥渣用95%乙醇室溫浸泡4天，過濾除去殘渣，合并兩次濾液，減壓濃縮，回收乙醇溶液，得到苦木的乙醇流動狀浸膏。

將上述浸膏用2 L pH 1～2的鹽酸水充分分散，過濾，得到酸水溶液，用濃氨水將酸水的pH調至9～10，然后用等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并4次乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，得到17 g總生物堿。

2.2 苦木生物堿成分的分離

用總生物堿17 g，拌樣上樣。以二氯甲烷∶甲醇(30∶1,20∶1,10∶1,5∶1，v/v)為洗脫劑，每個梯度洗脫液為柱體積的兩倍，以50 mL為一個收集流份，共收集得到23個組分。以薄層層析為檢測依據，將斑點清晰具有相同Rf值的合并為一組。其中1-8組分合并成一瓶，9-14組分合并成一瓶，15-23組分合并成一瓶。將1-8組分再次進行硅膠柱層析，以二氯甲烷∶甲醇(50∶1,40∶1,30∶1,25∶1,20∶1,甲醇v/v)為洗脫液，西林瓶收集，以薄層層析為檢測依據，合并相同組分，濃縮后丙酮重結晶，得到化合物1。

2.3 苦木生物堿成分的鑒定

化合物1：黃色針狀結晶，易溶于氯仿，mp.(224-225)℃。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.09(1H，d，J=8Hz)，8.87(1H，d，J=4.0Hz)，8.57(1H，d，J=8.0Hz)，8.09(1H，d，J=8.0Hz)，7.71(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，7.54(1H，td，J=4.0，8.0 Hz)，4.49(3H，s，C4-OCH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：116.77(C-1)，114.68(C-2)，145.96(C-4)，142.74(C-5)，158.08(C-6)，116.77(C-8)，130.75(C-9)，125.82(C-10)，122.77(C-11)，125.52(C-12)，138.75(C-13)，130.28(C-14)，126.07(C-15)，138.75(C-16)，61.07(C4-OCH3)。該化合物的核磁數據與文獻[13]報道的苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)一致，故該化合物被鑒定為苦木酮(4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮)，其結構如圖1。

圖1 苦木酮結構Fig.1 Structure of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6-dione

2.4 苦木主要生物堿成分的含量測定

2015版《中國藥典》在苦木藥材的質量控制方面僅有理化鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別，且薄層鑒別中沒有特征成分的鑒別，僅僅要求與對照藥材顯相同斑點，缺乏特征成分的含量測定，難以有效地控制藥材質量。我們以自制的苦木酮為對照品，對藥材中的特征生物堿進行了含量測定。色譜條件：Innoval ODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(B)-0.1%磷酸水溶液(A)，0-10 min 10% B - 33% B，10 min-20 min 33% B-40% B，20 min-25 min 40% B-10% B；紫外檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。在此色譜條件下，得到苦木酮和苦木乙醇提物的色譜圖(見圖2)。

配制濃度為8 μg·mL-1、16 μg·mL-1、32 μg·mL-1、48 μg·mL-1、64 μg·mL-1、80 μg·mL-1的苦木酮對照品溶液。在上述色譜條件下，進樣20 μL，測定峰面積值，以對照品峰面積值以及進樣濃度X(μg·mL-1)制作線性曲線，結果在濃度范圍(8～80)μg·mL-1內，苦木酮回歸方程為：Y=6.190×104X+7.831×104，R2=0.9994。

圖2 苦木酮(A)和苦木乙醇提物(B)的HPLC色譜

從圖2可以看出：苦木乙醇提取物的液相色譜圖中苦木酮的峰高及峰面積均是最大的，苦木酮是苦木的主要成分。我們測定了三批相同產地不同批次苦木的苦木酮，結果如表1。從表1我們可以看出，本次試驗所用三批藥材中苦木酮的含量約為萬分之七，為吳沖[7]等研究報道苦木中苦木酮含量的20%左右。

表1 苦木中苦木酮的含量測定

2.5 苦木主要生物堿成分的人源腸內菌的轉化研究

2.5.1 仿生人工胃液中穩定性研究

參照文獻[14]配置人工胃液：0.1 M稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水衡釋至1000 mL，即可。將苦木酮置于人工胃液中于37 ℃的環境中震蕩溫孵。按照2.4中的色譜條件分析，苦木酮在4 h內，在人工胃液中穩定。

2.5.2 人源腸內菌的轉化研究

參照文獻[14-15]配置厭氧培養液：L-半胱氨酸0.5 g，2 mL 25% L-抗壞血酸，牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，營養瓊脂1 g，37.5 mL A液(0.78% K2HPO4)，37.5 mL B液 [0.47% KH2PO4，1.2% (NH4)2SO4，1.8% NaCl，0.12% CaCl2，0.25% MgSO4]，50 mL 8% Na2CO3，加純化水至1 L，稀鹽酸調節pH至7.5～8.0。

腸內菌培養液的制備：按健康青年的新鮮糞便與滅菌生理鹽水1∶4 (g:m L)混合均勻，用無菌4層紗布過濾，再與厭氧培養液按照1∶9的比例混合，得到腸菌培養液。

以10 mL空白腸內菌培養液為空白對照(標記為A)，10 mL厭氧培養液加苦木酮為陰性對照(標記為B)，以10 mL腸內菌培養液加入苦木酮(體系中苦木酮質量濃度為12.5 μg/mL)為腸內菌轉化組(標記為C)。

將上述樣品置于37 ℃的厭氧培養箱中振蕩培養。分別于培養0 h，24 h，48 h和72 h時取樣，乙酸乙酯萃取后進行HPLC分析，分別得到0 h，24 h，48 h和72 h的液相分析圖，見圖3、圖4、圖5和圖6。

注：A為空白對照 ；B為陰性對照； C為轉化組； 1為苦木酮。圖3 苦木酮0 h人源腸內菌的轉化HPLCFig.3 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 0 h

注：A為空白對照 ；B為陰性對照； C為轉化組； 1為苦木酮。圖4 苦木酮24 h人源腸內菌的轉化的HPLCFig.4 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 24 h

注：A為 空白對照 ；B為陰性對照； C為轉化組； 1為苦木酮，2為轉化產物圖5 苦木酮48h人源腸內菌的轉化的HPLC Fig.5 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 48 h

注：A為 空白對照 ；B為陰性對照； C為轉化組； 1為苦木酮，2為轉化產物。圖6 苦木酮72 h人源腸內菌的轉化的HPLCFig.6 HPLC of 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6- dion Biotransformation by Human Intestinal Flora in 72 h

2.5.3 苦木酮的人源腸內菌的轉化放大試驗

配置腸菌培養液1 L，按上述操作方法加入50 mg 苦木酮，混勻。置于37 ℃厭氧培養箱中振蕩培養，72 h后，取出加等體積乙酸乙酯萃取2次，減壓濃縮乙酸乙酯，得到轉化產物。

將轉化產物通過硅膠柱層析分離純化，得到轉化產物的純品，即化合物2。

化合物2：黃色針狀結晶，易溶于氯仿，mp(145-146)℃。將化合物2的與化合物1的核磁譜圖仔細比較，發現多了一個甲氧基信號(δH4.07，δC61.17)，故猜測化合物2是化合物1的5位的羥基變成甲氧基。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.04(1H，d，J=4.0 Hz)，8.78(1H，d，J=4.0Hz)，8.57(1H，d，J=8.0 Hz)，7.72(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，7.54(1H，td，J=8.0，8.0 Hz)，8.15(1H，d，J=8.0Hz)，4.45(3H，s，C4-OCH3)，4.07(3H，s，C5-OCH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ：116.13(C-1)，145.19(C-2)，140.22(C-4)，139.18(C-5)，158.71(C-6)，116.72(C-8)，130.72(C-9)，125.64(C-10)，122.88(C-11)，124.75(C-12)，133.02(C-13)，128.44(C-14)，125.64(C-15)，130.98(C-16)，61.15(C4-OCH3)，61.17(C5-OCH3)。該化合物的核磁數據與文獻[13]報道的苦木堿丁(4,5-二甲氧基鐵屎米酮)一致，故該化合物鑒定為苦木堿丁(4,5-二甲氧基鐵屎米酮)，其結構及變化如圖7。

圖7 苦木酮在人源腸內菌作用下轉化成苦木堿丁Fig.7 4-methoxy-5-hydroxycanthin-6-dione was Transformed into 4,5-dimethoxycanthin-6-one by Human Intestinal Flora

3 討論與結論

a)通過苦木乙醇提取物的HPLC色譜圖發現苦木酮是苦木的主要生物堿成分，是苦木的主要特征成分之一。

b)通過研究表明苦木酮在人工胃液中穩定，表明口服含苦木的制劑，苦木酮大部分以原型的形式進入腸道?？嗄就谌梭w腸道微生物及微生物分泌的酶的作用下發生變化，由于微生物酶的作用，苦木酮上的羥基變成甲氧基，轉化成極性較低的苦木堿丁，增強了化合物的脂溶性，有利于藥物分子透過腸系膜進而被吸收，增大了藥物的生物利用度。

c)劉軍峰[16]等研究表明苦木酮和苦木堿丁對磷酸二酯酶4有抑制活性，但苦木堿丁表現出更強的抑制作用；同時苦木堿丁相對于苦木酮而言，對肺炎球菌的抑菌更顯著[2]。由此可見，苦木酮在人體腸道微生物及微生物分泌的酶的作用下藥效增強了。