樂山地區竹燕窩不同發育時期的細胞學研究

禹小波，鐘勝男，胡 燁，農 向※

(1.竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室(樂山師范學院)，四川 樂山 614000；2.樂山師范學院 生命科學學院，四川 樂山 614000)

0 引言

竹燕窩，學名海綿膠煤炱菌(Scoriasspongiosa)，因其味道鮮美，營養價值高，是一種高檔的可食用真菌[1]。竹燕窩除了營養豐富，還具有抗氧化性[2]、抑菌和抗癌等效果[3-5]，因而具有較大的市場潛力。但由于其生長環境較為苛刻，目前市場上供應的竹燕窩僅靠野生采集,尚無人工培育成功的報道。之前的研究表明，海綿膠煤炱菌在PDA培養基(PotatoDextroseAgarMediam)可以生長且易產生分生孢子，但并不能形成大型的子實體[6]。因此，利用PDA培養基對其進行培養雖不具有實用價值，但卻為研究竹燕窩的生長發育提供了一個很好的契機。

海綿膠煤炱菌在分類地位上屬于子囊菌門，盤菌亞門，座囊菌亞門，座囊菌綱，煤炱菌目，煤炱菌科，膠煤炱菌屬。第一份海綿膠煤炱菌標本于1832年被收集并鑒定，編號為Carolina 1311[7]。但之后，國內外有關該菌的研究較少。 研究真菌的生長發育規律，特別是各種細胞類型的分化和細胞命運特化的過程，對于發育生物學而言具有重要的學術價值，同時也對于認識其野生條件下的生長規律及人工培育系統的建立有著重要的借鑒意義。本研究通過對樂山地區的竹燕窩進行采集和菌種分離后，利用PDA培養基對其進行純培養。通過對竹燕窩各個發育階段的細胞形態進行了詳細的細胞學觀察，為后續竹燕窩的生長機制研究和人工培育系統的建立提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

菌種分離的竹燕窩樣品來源采樣地點：樂山師范學院校內竹林和樂山市萊茵水岸小區竹林。采樣時間。2019年11月。

1.1.2 主要試劑

PDA固體培養基，PDA液體培養基，無菌蒸餾水，50%甘油。

1.1.3 試驗儀器

Leica DM500光學顯微鏡，恒溫培養箱，高溫高壓滅菌鍋，-80 ℃超低溫冰箱，超凈臺，研缽，鑷子，載玻片，錐形瓶，牙簽，EP管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹燕窩菌種分離與保存

將野外采集的竹燕窩在超凈臺上使用無菌水沖洗3次，然后再放入無菌的研缽中研磨粉碎，無菌水重懸，梯度稀釋于PDA培養基上，置于24 ℃培養箱中培養至單菌落出現(圖1B-D)。將遠離細菌污染的竹燕窩單菌落轉移到新的PDA培養基上培養至產生分生孢子。使用無菌牙簽挑取分生孢子，保存至50%甘油中，-80℃保存。

1.2.2 竹燕窩不同發育時期的光學顯微鏡觀察

對分離的分生孢子使用固體/液體PDA培養基培養，每隔12 h取樣進行鏡檢觀察。

2 結果與分析

2.1 竹燕窩的生活環境：竹—蚜—菌三者的共生關系

竹燕窩僅出現在被居竹偽角蚜感染的竹林中，竹燕窩、竹林和蚜蟲三者形成了獨特的植物-昆蟲-真菌的共生關系。其中，居竹偽角蚜(PseudoregmaBambusicola)是一種傾向于感染新生竹的蚜蟲。與很多其他昆蟲一樣，居竹偽角蚜在吸取竹子營養的同時，也會分泌富含糖分的蜜露并導致竹子感染煤污病。這種煤污病的病原菌即是海綿膠煤炱菌。在條件適宜的情況下，煤污病會形成大型的真菌子實體即竹燕窩。雖然很多煤炱科的真菌都會導致煤污病，但在煤炱科中只有海綿膠炱菌能夠形成大型的真菌子實體，也是目前報道的該科中唯一可食用的真菌，因而備受關注。

2.2 竹燕窩的菌種分離和形態觀察

野生的生長狀態良好的竹燕窩呈金黃色珊瑚狀分支，富有彈性；衰老黑化的部分則呈黑煤塊狀，不具彈性(圖1A)。使用研磨粉碎的竹燕窩子實體在PDA培養基上24℃培養則會長出晶瑩剔透的竹燕窩組織團(圖1D)，與野外新生的竹燕窩顏色相同。竹燕窩生長過程的顏色變化規律為：無色透明—淺黃色—金黃色—暗黑色—黑色。

A.竹燕窩取樣；B.竹燕窩新生部分子實體； C.研磨粉碎的竹燕窩子實體；D.PDA培養基 生長出的竹燕窩組織團圖1 竹燕窩菌種分離過程Fig.1 Isolation of Scorias spongiosa strain

A.竹燕窩組織塊，顯示菌絲體；B.竹燕窩組織塊 開始形成珊瑚狀子實體；C.竹燕窩形成大量的珊 瑚狀子實體；D.竹燕窩子實體形成分生孢子球， 標尺=100 μm。圖2 竹燕窩組織塊形態觀察Fig.2 Morphological Observation of Scorias Spongiosa Tissues

在顯微鏡下觀察PDA培養基上的竹燕窩，發現其向四周輻射生長出菌絲體，而中間的組織團則類似植物的愈傷組織(圖2A)。在PDA培養基上，竹燕窩的菌絲體并不發達，只能局限在組織塊周圍，形成少量的菌絲(圖2A)。組織塊可以快速生長并在其表面產生突起，最終發育成為珊瑚狀子實體(圖2B和圖2C)。在PDA培養基上，這些珊瑚狀突起最終會分化形成分生孢子器，成熟的分生孢子器會在其頂端形成透明的分生孢子球(圖3D)。

A.竹燕窩分生孢子，標尺=20 μm; B.萌發的分生孢子，標尺=20 μm；C.由單個分生孢子發育而來的菌絲體，標尺=100 μm；D.竹燕窩菌絲體在中央開始形成細胞團，標尺=20 μm；E.竹燕窩細胞團變大，并開始分泌膠質物質，標尺=20 μm；F.竹燕窩菌絲體形成管狀細胞，標尺=20 μm；G-I.菌絲體形成環狀結構，標尺=20 μm；J-L.竹燕窩菌絲體分化出束狀細胞，標尺=20 μm。

2.3竹燕窩營養生長的細胞學特性

由于固體PDA培養基上的竹燕窩會產生大量的膠質，不易于觀察其生長發育的規律，我們將其接種到PDA液體培養基中，進行培養觀察，以減少竹燕窩膠質帶來的干擾。在分生孢子球上的分生孢子呈卵形或橢圓形，無色透明，單細胞(圖3A)。接種到液體PDA培養基中12 h后，分生孢子的體積迅速膨大并萌發產生菌絲，菌絲呈頂端生長，含中央大液泡(圖3B)。分裂數次后的分生孢子最終會形成具有分支的竹燕窩菌絲體，分支的位置一般位于菌絲體的中央部位，而新分裂的細胞則一般不會形成分支(圖3C)。繼續培養觀察后發現，菌絲體傾向于圍繞中央，以盤繞螺旋的方式生長并形成致密的細胞團，即子實體原基(圖3D)。細胞團原基會迅速擴大并開始積累膠質物質，使組織團呈現淡黃色(圖3E)。與此同時，原基周圍的菌絲體會隨機形成致密的細胞突起(圖3F)并最終和其他菌絲體細胞融合交聯，形成環形的菌絲體(圖3G和圖3H)。菌絲體環的交聯節點可以為一個或者數個(圖3I)。之后，竹燕窩子實體的部分細胞開始分化形成菌絲盤繞的束狀細胞，并最終發育成為珊瑚狀子實體。束狀細胞的下部為疏松細胞，體積較大(圖3J)，中部為網狀菌絲體(圖3K)，上部則為菌絲體盤繞的束狀細胞群(圖3L)。

2.4 竹燕窩生殖生長的細胞學特性

竹燕窩營養生長的子實體呈典型的珊瑚狀(圖4A)。在PDA培養基上，子實體會逐漸分化形成分生孢子器，并產生分生孢子球(圖4B)。分生孢子球呈白色，具黏性，易從分生孢子梗上脫落(圖4C和圖4D)。竹燕窩的分生孢子器具長梗，底部呈燒瓶狀，向頂端逐漸縮小(圖4E)。分生孢子由分生孢子器底部的菌絲產生(圖4F)。中間的分生孢子梗由螺旋卷曲的菌絲組成，平行排列，顏色深褐色或黑色，其功能為運輸分生孢子(圖4G)。分生孢子器頂端由無色透明的菌絲體組成，具開孔，分生孢子器未成熟時關閉，成熟時張開，釋放分生孢子(圖4H)。

A.竹燕窩的珊瑚狀子實體，標尺=500 μm;B.成熟的分生孢子球，標尺=200 μm；C.分生孢子球脫落到培養基表面，標尺=100 μm；D.脫落了分生孢子球的分生孢子器，標尺=200 μm；E.未成熟的分生孢子器整體結構，標尺=100 μm；F.分生孢子器底部菌絲體，標尺=20 μm；G.分生孢子梗菌絲體，標尺=20 μm；H.分生孢子器頂端無色菌絲體，標尺=20 μm

3 結論與討論

本文通過對樂山地區的竹燕窩進行菌種分離并利用PDA培養基進行純培養，對其不同發育時期的細胞進行觀察分析表明，竹燕窩的生活史為分生孢子—菌絲體—膠質菌絲體—分生孢子器—分生孢子，整個生活史周期中只有無性的生殖過程，未見有性生殖過程。

竹燕窩的分生孢子萌發過程類似頂端生長過程，這一規律與其他絲狀真菌的生長規律一致[8]。竹燕窩的菌絲體傾向于在細胞中部位置螺旋盤繞生長形成子實體原基。在這個過程中，菌絲體之間通過相互融合，形成復雜的菌絲體網絡，這一過程可能是竹燕窩可以形成大型的膠質子實體是根本原因。值得注意的是，這個過程中菌絲體中部盤繞形成以及交聯形成網狀結構的細胞學過程是研究細胞融合的良好材料。

在竹燕窩的子實體生長過程中，菌絲體會分泌產生大量的膠質物質，這些物質可能有助于菌絲體原基的聚集或生長，但具體功能還有待進一步探究。由于竹燕窩的主要營養成分、抗氧化物質和抗癌物質都來源于膠質[3-4，9-10]，竹燕窩的膠質分泌的影響因子研究和分泌機制對于提高其營養價值十分重要。有研究表明，使用Tween80和氯仿刺激可以增加其胞外多糖含量的分泌[11]，但由于這些物質為有毒物質，因此無法應用于食品生產中。

在竹燕窩的生殖生長過程中，束狀菌絲的形成對于產生分生孢子器是必須的。束狀菌絲生長快速，這為細胞學過程為竹燕窩可以形成大量的珊瑚狀分枝提供了細胞學依據。有趣的是，并不是所有的束狀菌絲都會直接分化產生分生孢子器，部分的束狀菌絲產生的珊瑚狀分支可以形成二級或三級分支，在野外條件下，這種分支結構使得竹燕窩可以形成獨特的大型珊瑚狀子實體。在實驗條件下不能產生大型子實體可能是由于在PDA培養基上不具備野外的調控因子。

綜上表明，本研究對樂山地區的竹燕窩生長發育的細胞學進行了較為詳細的觀察，對于竹燕窩生長發育的機制研究及進一步開發利用野生竹燕窩資源和人工培育系統的建立提供了一定的理論依據。