Raf激酶抑制蛋白表達水平與非小細胞肺癌放射敏感性的關系

韓沖，于洋洋，黨軍，姚雷，李光

（中國醫科大學附屬第一醫院放射治療科，沈陽 110001）

肺癌是目前全世界發病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的85%～90%［1］。放射治療是局部進展期NSCLC的主要治療手段［2］，但局部進展期NSCLC的5年生存率不足15%［3］，局部未控率高達70%，放射抗拒是影響放射治療效果的主要生物學因素［4］。深入了解細胞放射敏感性的影響因素，找出特異性的分子靶點，在放射治療前準確預測NSCLC的放射敏感性是實現NSCLC個體化、高效治療的關鍵。

Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達減少［5］，與Raf-1/MEK/ERK、G蛋白耦聯受體、核因子κB（nuclear factor-kappa B）、Wnt等多種信號通路的調節有關，導致腫瘤進展及治療抵抗［6］。本研究通過檢測放射治療前NSCLC組織中RKIP的表達，分析RKIP蛋白表達與放射敏感性的相關關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2012年至2014年在我院行根治性放射治療的NSCLC患者，共106例，卡氏（Karnofsky，KPS）評分均≥80分。其中，男76例，女30例；年齡40～83歲（中位年齡61歲）；鱗狀細胞癌72例，腺癌34例。參考國際抗癌聯盟第八版肺癌TNM分期標準分期，T112例，T249例，T338例，T47例，N0～1期52例，N2～3期54例；臨床分期Ⅱ期59例，Ⅲ期47例。所有病例入組時均無手術適應證，均未行同期化學治療。

1.2 放射治療

用真空墊及熱塑體模固定患者，行C4～L2椎體下緣范圍5 mm層厚CT增強定位；將CT掃描信息傳輸至Pinnacle9.0（美國ADAC公司）放射治療計劃系統，由2名臨床醫師勾畫大體腫瘤區（gross target volume，GTV）和危及器官（organ at risk，OAR）；原發病灶為GTV，縱隔區腫大淋巴結（短徑＞1 cm）為GTVnd。GTV外放6～8 mm為臨床靶區（clinical target volume，CTV），不做縱隔淋巴引流區預防性照射。計劃靶區（planning target volume，PTV）在CTV的基礎上前后左右外放5 mm，上下外放10 mm。采用適形調強放射治療技術，6 MV-X線照射，2 Gy/次，1次/d，5次/周。初治劑量達到40 Gy時再次行CT定位，根據瘤體變化情況修改腫瘤靶區繼續放射治療，總劑量達到60～66 Gy/30～33次。

1.3 放射敏感性及近期療效評價

放射治療至40 Gy時再次行CT定位，并將圖像與放射治療前圖像融合，利用TPS系統的體積計算模塊計算原發病灶GTV縮小百分率，應用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線截點值區分以GTV縮小百分率為評價指標的放射敏感性。

1.4 免疫組化染色及判定

放射治療前病理活檢組織標本均以10%甲醛固定，石蠟包埋封存，并經HE染色病理確診。采用兔抗人RKIP多克隆抗體（sc-28837，美國Santa Cruz生物工程公司）。切片微波抗原修復后，行SP法免疫組化染色，DAB顯色，RKIP定位于細胞質。判定標準：高倍鏡下（×400）每張切片隨機選擇5個視野，計數200個細胞/視野，輔以計算機圖像分析結果，以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。RKIP蛋白表達無陽性細胞為0分，陽性細胞簇≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞積分與著色強度積分分別相加：0～2為低表達（-），3～5分為中表達（+），6～7分為高表達（++），其中（+）和（++）判定為陽性［7］。所有結果均由2名病理醫師采用盲法單獨判定。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件包進行數據處理。評分截點值采用ROC曲線分析，率的比較采用χ2檢驗，放射敏感性相關的多因素分析應用logistic回歸分析，指標間相關性分析應用Spearman等級相關分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RKIP表達水平及其與NSCLC臨床病理特征的關系

免疫組化染色結果顯示，RKIP蛋白陽性表達率為65.1%（69/106），見圖1。無縱膈淋巴結轉移（N0～1）的NSCLC患者RKIP陽性表達率［84.6%（44/52）］高于有縱膈淋巴結轉移（N2～3）的患者［46.3%（25/54）］，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。臨床分期Ⅱ期的NSCLC患者RKIP陽性表達率為［79.7%（47/59）］高于Ⅲ期患者［46.8%（22/47）］，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖1 NSCLC中RKIP的表達 SP法 ×400Fig.1 Expression of RKIP in NSCLC SP ×400

RKIP表達與患者的性別、年齡、病理類型及原發腫瘤T分期之間無相關性（P＞ 0.05），見表1。

表1 NSCLC組織中RKIP的表達結果及其與NSCLC臨床病理特征的關系Tab.1 Expression of RKIP proteins in NSCLC and relationship with clinicopathological factors

2.2 NSCLC放射敏感性與臨床分期及RKIP表達水平的Spearman相關性分析

對106例NSCLC患者GTV縮小百分率進行ROC曲線分析，截點值為33.6%，特異度84.1%，靈敏度81.4%，見圖2。將＜33.6%定義為低放射敏感，≥33.6%定義為高放射敏感，低放射敏感者37例，高放射敏感者69例。Spearman相關分析顯示，臨床分期及RKIP表達水平與NSCLC的放射敏感性具有相關性（r=-0.235，P＜ 0.05；r=0.257，P＜ 0.05），臨床分期早、RKIP表達水平高的NSCLC患者放射敏感性高。而性別、年齡、病理類型及原發腫瘤T分期、淋巴結轉移N分期與NSCLC患者放射敏感性無明顯相關性（r分別為-0.072、-0.091、0.003、0.166、-0.040，P＞ 0.05），見表2。

表2 影響NSCLC放射敏感性的臨床因素Spearman分析Tab.2 Spearman analysis of clinicopathological factors affecting radiosensitivity of NSCLC

圖2 NSCLC 患者GTV縮小ROC曲線Fig.2 GTV reduces ROC curve in NSCLC

2.3 影響NSCLC放射敏感性的logistic多因素分析

將上述P＜ 0.05的因素（臨床分期以及RKIP表達情況）納入logistic回歸模型中，分析結果顯示，RKIP表達水平是NSCLC放射敏感性的獨立相關因素（Wald=4.041，P=0.044），見表3。

表3 影響NSCLC放射敏感性的logistic多因素分析結果Tab.3 Multivariate logistic analysis of factors affecting the radiosensitivity of NSCLC

3 討論

RKIP屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族，是近年來發現的一種新的腫瘤轉移抑制因子，在多種人類惡性腫瘤（如肺癌、前列腺癌、肝細胞癌、結直腸癌、乳腺癌及鼻咽癌）中，RKIP蛋白的表達明顯減少［5］，尤其在轉移的淋巴結中RKIP蛋白不表達或者顯著降低［8-9］，RKIP蛋白表達下降與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移相關，增加RKIP的蛋白表達可以調控細胞通路，抑制血管生成，阻止脈管入侵，顯著抑制腫瘤的侵襲、轉移能力。文獻［6］報道，RKIP蛋白過表達可逆轉腫瘤細胞的化學、免疫、放射治療抵抗性，并重啟免疫系統對腫瘤細胞的監視及清除作用。胡春杰等［10］發現，上調宮頸癌細胞RKIP基因的表達能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移，是宮頸癌治療的新靶點。劉學飛等［11］研究發現RKIP與乳腺癌的惡化程度有關，RKIP能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲，且其作用機制可能是通過對NF-κB的負調控而實現。

NSCLC具有高侵襲性、高轉移性及放化療抵抗，與腫瘤細胞逃逸宿主免疫監視及異常免疫應答有關，嚴重影響肺癌患者的治療效果，是導致患者高死亡率的重要原因。肺癌侵襲與轉移的分子機制是目前急需研究探討的課題。本研究結果顯示，隨臨床分期進展，NSCLC組織中RKIP蛋白表達陽性率逐步降低（P＜ 0.05）；RKIP蛋白表達在有縱隔淋巴結轉移的NSCLC中較無縱隔淋巴轉移者明顯降低（P＜ 0.05）；RKIP蛋白表達與患者的性別、年齡、病理類型及原發腫瘤T分期無關，證實了RKIP蛋白在NSCLC的發生、發展和淋巴結轉移的機制中起重要作用，提示RKIP在肺癌中可能是腫瘤抑制因子。其具體機制可能與參與Raf-1/MEK/ERK、G蛋白耦聯受體和NF-κB等多種信號通路的調節有關［12］。RKIP也可通過干擾GSK3β影響細胞分裂和凋亡［6，13］。

迄今為止的癌癥模型中，RKIP被認為具有細胞凋亡誘導劑的作用，并能夠啟動抗性腫瘤細胞對常規治療方式的再敏化和對宿主免疫監視的敏感性。RKIP是一種可提高化學治療效果的增敏劑，已在宮頸癌、肺腺癌、胃癌、前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤中得以證實［13］。最近，YUAN等［14］發現RKIP表達低的鼻咽癌患者臨床分期及淋巴結轉移率均高，且放射敏感性低，預后不良，是鼻咽癌的獨立預后因素。體外培養細胞研究發現，沉默RKIP表達后，鼻咽癌細胞的放射敏感性降低，而上調鼻咽癌細胞RKIP表達則可通過減少Raf-1/MEK/ERK 通路中MEK和ERK的磷酸化作用，提高放射誘導的細胞凋亡，從而提高鼻咽癌細胞的放射敏感性。目前，RKIP蛋白表達與NSCLC放射敏感性相關關系的報道極少，近年有研究［7］發現RKIP基因沉默和RKIP蛋白表達下降可能激活了NSCLC中Shh信號轉導通路的表達，使NSCLC細胞具有腫瘤干細胞屬性，產生幾乎無限的復制潛力，將明顯提高腫瘤細胞的放射抵抗能力。本研究中，Spearman相關性分析結果顯示，臨床分期及RKIP表達水平與NSCLC的放射敏感性具有相關性，臨床分期早、RKIP表達水平高的NSCLC患者放射敏感性高。多因素分析顯示，RKIP表達水平是NSCLC放射敏感性的獨立相關因素。表明RKIP可做為預測NSCLC放射敏感性的有效生物學指標，對實現NSCLC放射敏感性的基因靶向調節、有針對性地進行個體化治療具有重要意義。