針刺對咳嗽變異性哮喘大鼠MMP-9、TIMP-1表達的影響

李莉莎,汪今朝,王鳳嬋

（1.青島市中醫院肺病診療中心,青島 266033;2.湖北省中西醫結合醫院,武漢 430021）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma,CVA）是以咳嗽為唯一臨床表現、但不出現喘息的一種特殊類型哮喘,是兒童慢性咳嗽的主要原因之一,若不及時加以救治,部分患者會演變成終身哮喘[1]。研究證實CVA的主要病理機制為出現在氣道的慢性非特異性炎癥,以及氣道重塑等[2]。大量研究表明,基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9,MMP-9）及基質金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）在氣道的慢性非特異性炎癥發生,以及氣道重塑中扮演重要角色[3-4]。MMP-9是一種能促進基底膜分解的酶類,其異常的活化可破壞基底膜,導致炎性因子擴散,TIMP-1大量生成后,可促進膠原纖維的異常增生,以致膠原沉積,最終發展成氣道重塑[5-6]。

臨床上多用布地奈德以及孟魯司特等藥物治療CVA,雖有一定的療效,但因藥物治療的局限性以及藥物所帶來的副作用等也被學者們廣泛擔憂,因此尋找一個療效顯著,副作用小的治療 CVA的方案迫在眉睫[7-8]。針刺作為中醫學的特色療法,因其副作用小,治療靶點多等優勢在基礎研究及臨床治療中被廣泛使用,且研究發現針刺能有效治療 CVA[9-10],但其是否能調控CVA后MMP-9、TIMP-1的表達,尚未見相關文獻報道,本研究旨在觀察針刺肺俞、腎俞穴對CVA大鼠咳嗽次數、肺組織膠原沉積程度以及MMP-9,TIMP-1表達的影響,探討其治療CVA的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48只4周齡SPF級SD大鼠,體質量（80±10）g,購于上海斯萊克實驗動物公司,實驗動物許可證為SCXK（滬）2014-0003,飼養于青島市實驗動物中心,每日給與足量無菌飼料及水分,適量光照。將所有大鼠編號后,按照隨機數表法隨機分為正常組、模型組和治療組,每組16只。所有大鼠飼養于青島市實驗動物中心,本研究符合青島市中醫醫院醫學倫理學要求。

1.2 主要實驗試劑及儀器

卵蛋白（A5503,美國 Sigma公司）,氫氧化鋁（20001060,北京市化學試劑公司）,辣椒素（C191,美國Sigma公司）,兔抗鼠MMP-9抗體（10375-2-AP,武漢三鷹）,兔抗鼠 TIMP-1抗體（16644-1-AP,武漢三鷹）,羊抗兔二抗（SA00004-2,武漢三鷹）,免疫組化試劑盒（FD008,上海碧云天生物技術有限公司）,BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012S,上海碧云天生物技術有限公司）,DAB顯色試劑盒（P0202,上海碧云天生物技術有限公司）,顯微鏡及顯微照相系統（日本Olympus公司）,電泳系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 模型制備

聯合運用卵蛋白和氫氧化鋁刺激大鼠建立CVA大鼠模型[11]。大鼠腹腔注射4%卵蛋白溶液0.5 mL,同時注射2%氫氧化鋁溶液0.2 mL,每日1次,連續干預14 d后,將大鼠置于玻璃罩內給予 1%卵蛋白溶液的生理鹽水霧化激發2 min,每日1次,連續干預7 d,若大鼠表現出咳嗽、呼吸急促、腹肌收縮、抽搐等現象,則提示CVA模型建立成功[11],本研究中模型組和治療組大鼠咳嗽次數,氣道炎癥反應較正常組顯著增高,亦證實模型建立成功。

1.4 干預方法

自造模開始14 d后,每日行激發試驗前對治療組大鼠肺俞、腎俞穴進行針刺干預,根據李忠仁版《實驗針灸學》[12]對大鼠進行穴位定位,腎俞位于大鼠第二腰椎棘突下兩旁7 mm（大鼠第9～11胸椎棘突緊湊,可于皮下觸及,由下緣向下尋摸4個椎體,即為第二腰椎）,肺俞穴定位于第三胸椎棘突下兩旁 7 mm（大鼠第二胸椎是頸胸彎曲的最低點,以此找到第二胸椎,向下尋摸1個椎體即為第三胸椎）,每個穴位針刺深度為 5 mm,留針30 min,每15 min采用捻轉法行針1次,每日治療1次,連續治療14 d。

1.5 取材

每組隨機取8只大鼠,采用7%水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠后,進行夾板固定,打開大鼠胸腔注意不損傷肺及心臟,暴露整個肺部,快速對右側肺門進行結扎,取右側肺組織迅速于-80 ℃下保存備用。取出另一部分新鮮肺組織搗碎,高速離心 20 min（離心半徑為10 cm,轉速13000 rpm）,吸取上清液于-80 ℃下保存以用于ELISA檢測。每組剩余8只大鼠重復上述步驟暴露胸腔后,用手術剪自大鼠心尖處剪一小口,插入灌胃針,并連接針筒后,用150 mL生理鹽水溶液快速注入以沖洗大鼠全身血管,直至心臟顏色變為淡紅色后,用4%的多聚甲醛溶液自心臟缺口處對大鼠進行灌注固定,取右側肺組織,于4%多聚甲醛溶液中固定2天,梯度乙醇溶液脫水、二甲苯溶液透明肺組織以及進行石蠟包埋操作后,制成厚度為5 μm的肺組織切片,用于HE染色、Masson染色及免疫組化實驗。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠咳嗽次數測定

將大鼠放入玻璃罩內,霧化吸入1×10-4mol/L辣椒素溶液,連續刺激1 min,停止刺激后,讓大鼠于玻璃罩內再停留 1 min,打開玻璃罩,開始記錄此刻開始2 min內大鼠的咳嗽次數。大鼠表現出抓鼻、喉部發聲、抽搐等任一現象可記錄為1次咳嗽,由兩名實驗員同時記錄。

1.6.2 肺組織病理學觀察

將上述切片經HE染色和封片后,置于光學顯微鏡下觀察并記錄組織病理學變化。采用Masson法對膠原進行染色,將上述組織進行抗原修復后,采用蘇木素-氯化鐵混合液避光染色5 min后,滴加酸性乙醇分化液,分化5 s后,用PBS緩沖液漂洗1 min,滴加堿性氨水溶液進行返藍1 min,PBS緩沖液漂洗1 min,滴加立春紅染液染色 5 min,濾紙吸去液體,滴加磷鉬酸溶液反應1 min后,濾紙吸去液體,滴加甲苯胺藍染色液1 min,光鏡下觀察染色情況,梯度乙醇脫水,二甲苯透明、中性樹脂封片。并運用Image J圖像處理軟件分析各組膠原面積,從而計算出膠原沉積程度（膠原沉積程度＝膠原面積/組織總面積）。

1.6.3 免疫組化法檢測MMP-9和TIMP-1蛋白表達

上述肺組織石蠟切片常規脫蠟后,用枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復;PBS溶液漂洗3次后加入過氧化物酶阻斷劑反應10 min;PBS溶液漂洗3次后滴加封閉液反應 1 h,后迅速加入一抗反應 1.5 h后,PBS溶液洗 3次,加入二抗作用1 h,再加入鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液作用15 min,最后滴加DAB顯色液,再進行蘇木素復染,酒精梯度脫水,二甲苯溶液透明,中性樹脂封片于鏡下觀察并拍片。運用Image J圖像處理軟件分析各組MMP-9和TIMP-1的平均光密度值。

1.6.4 Western blot法檢測肺組織MMP-9和TIMP-1蛋白表達

采用 BCA法測定總蛋白濃度后進行上樣處理,依次進行凝膠電泳,轉至PVDF膜上,用脫脂奶粉于4 ℃下封閉1.5 h后加入配置好的MMP-9和TIMP-1單克隆抗體在 4 ℃下充分孵育反應過夜,PBST溶液漂洗,加入二抗于常溫下作用1.5 h后進行顯色處理,采用凝膠成像系統顯示條帶。用quantity one灰度分析軟件對條帶進行光密度分析,計算出灰度值,以被檢測的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.6.5 ELISA法檢測肺組織中IL-8的表達

將上述在-80 ℃下保存的肺組織離心后,用 PBS緩沖液按照1:100比例稀釋,使用ELISA試劑盒按照樣本說明書進行操作,取出ELISA試劑盒中96孔板進行加樣,然后加標準品反應15 min后、加生物素抗體工作液常溫避光反應 20 min、再加底物工作液反應20 min、最后加入終止液終止反應,放入酶標儀內于450 nm波長進行檢測。

1.7 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示;多組間比較采用單因素方差one-way ANOVA分析;不符合正態分布且方差齊的數據采用 Kruskal-Wallis秩和檢驗處理;符合正態分布但是方差不齊的數據運用Student’s-test檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠咳嗽次數比較

與正常組比較,模型組大鼠咳嗽次數明顯增多,差異有統計學意義（P＜0.05）,與模型組相比,治療組大鼠咳嗽次數顯著減少,差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠咳嗽次數比較 （±s）

表1 各組大鼠咳嗽次數比較 （±s）

注:與正常組比較1）P＜0.05;與模型組比較2）P＜0.05

組別 n 咳嗽次數正常組 16 2.12±1.58模型組 16 15.06±5.221）治療組 16 9.56±3.682）

2.2 各組大鼠組織病理形態比較

正常組肺泡形態正常,結構完整,肺間質內未見明顯藍色顆粒樣炎性因子浸潤,組織間隙未見明細充血水腫,未見纖維化增生;模型組與正常組比較,鏡下可見大量炎性因子浸潤,組織間隙充血、水腫嚴重,平滑肌、部分肺泡塌陷,組織纖維纖維化嚴重;治療組與模型組相比,炎性因子浸潤情況顯著改善,組織間隙充血、水腫情況減少,肺組織纖維化程度明顯減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結果（×200倍）

2.3 各組大鼠膠原沉積程度比較

肺組織Masson染色紅染部分為平滑肌組織,藍染部分為膠原組織。正常組肺泡形態完整,肺泡間質可見少許膠原藍染;模型組可見大量肺泡塌陷,肺泡壁增厚,膠原藍染大量聚集,膠原面積增大;治療組可見少許肺泡塌陷,膠原藍染少量聚集,膠原沉積程度小于模型組,差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肺組織Masson染色結果（×200倍）

表2 各組大鼠膠原沉積程度比較 （±s）

表2 各組大鼠膠原沉積程度比較 （±s）

注:與正常組比較1）P＜0.05;與模型組比較2）P＜0.05

組別 n 膠原沉積程度正常組 8 0.23±0.08模型組 8 0.72±0.191）治療組 8 0.48±0.132）

2.4 各組大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白表達分布情況

與正常組比較,模型組MMP-9和TIMP-1的表達顯著升高,差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較,治療組MMP-9和TIMP-1表達減少,差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組MMP-9蛋白的平均光密度值比較 （±s）

表3 各組MMP-9蛋白的平均光密度值比較 （±s）

注:與正常組比較1）P＜0.05;與模型組比較2）P＜0.05

組別 n MMP-9 TIMP-1正常組 8 0.25±0.14 0.18±0.11模型組 8 0.63±0.211） 0.56±0.191）治療組 8 0.49±0.192） 0.42±0.162）

免疫組化結果顯示MMP-9和TIMP-1主要表達于胞漿中,如圖中紅色箭頭所示呈現棕褐色,彌漫性分布于組織中。詳見圖3。

圖3 MMP-9,TIMP-1陽性表達結果（×200倍）

2.5 各組大鼠MMP-9和TIMP-1蛋白表達比較

Western blot結果顯示與正常組比較,模型組MMP-9和TIMP-1蛋白表達升高,差異有統計學意義（P＜0.05）;與模型組相比,治療組MMP-9和TIMP-1蛋白表達減少,差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖 4、表4。

圖4 MMP-9和TIMP-1蛋白表達條帶圖

表4 各組MMP-9蛋白表達情況比較 （±s）

表4 各組MMP-9蛋白表達情況比較 （±s）

注:與正常組比較1）P＜0.05;與模型組比較2）P＜0.05

組別 n MMP-9/GAPDH TIMP-1/GAPDH正常組 8 0.12±0.09 0.19±0.11模型組 8 0.68±0.251） 0.64±0.201）治療組 8 0.43±0.152） 0.47±0.152）

2.6 各組大鼠肺組織中IL-8的表達比較

ELISA結果顯示與正常組比較,模型組和治療組IL-8的表達量顯著升高,差異具有統計學意義（P＜0.05）;與模型組比較,治療組 IL-8含量顯著降低,差異具有統計學意義（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠IL-8表達量比較 （±s,pg/mL）

表5 各組大鼠IL-8表達量比較 （±s,pg/mL）

注:與正常組比較1）P＜0.05;與模型組比較2）P＜0.05

組別 n IL-8正常組 8 19.68±2.14模型組 8 52.74±8.661）治療組 8 38.83±5.282）

3 討論

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma,CVA）是一種發生在小兒呼吸系統的疾病,現代醫學認為CVA的發生機理類似于哮喘,都是由過敏原所引起的,病理表現為氣道炎癥以及反應性的增加[13]。研究發現MMP-9和TIMP-1與氣道炎癥以及反應性增加密切相關,MMP-9屬Ⅳ型膠原酶,能夠對Ⅳ型膠原起到降解作用,是維持細胞外基質穩態的主要酶[3-6]。MMP-9反應性升高后,大量生長因子前體會發生裂解,開始出現病理性降解膠原蛋白等細胞外基質的主要成分,最終導致基底膜發生破壞,此時大量炎癥因子可透過基底膜進入支氣管壁中,進而引起氣道炎癥。此外,MMP-9可黏附于附著在氣道壁上的炎性因子IL-8,并增強IL-8的活性,研究發現,這種兩者附著后的狀態能使 IL-8的炎癥作用提高10倍,因此肺組織中MMP-9的表達量也可反應出氣道炎癥的嚴重程度[14-18]。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制物,可由各種組織細胞分泌,且MMP-9的異常升高可向組織提供信號,這些信號分子會促使TIMP-1反應性升高進而去發揮其自身抑制MMP-9的特性,病理狀態下,這種平衡一旦打破,導致TIMP-1大量生成,TIMP-1發揮其抑制細胞外基質降解的作用,從而促進膠原纖維的異常增生,導致膠原沉積,阻礙組織的修復[5-6]。最終這些氣道壁上過多的病理性膠原沉積會引起氣道壁纖維化和氣流阻塞,使得氣道重塑,從而表現出咳嗽增多現象,故而肺組織中TIMP-1的表達狀況可顯著反應出組織纖維化的嚴重程度,被認為是氣道重塑的標志。本次實驗中,模型組大鼠咳嗽次數顯著高于正常組,且模型組MMP-9和TIMP-1的表達顯著高于正常組,這與以往學者們的研究類似。中醫學者認為,咳嗽變異性哮喘屬于風咳、久咳、哮咳范疇[19-22],外感風邪導致肺氣失宣、氣道攣急,繼而出現咳嗽,小兒肺常不足,臟器嬌嫩,若外邪侵襲日久出現咳嗽遷延不治,且損傷臟器,肺陰虧損,腎主納氣功能失調,進而又表現出久咳、哮等癥狀出現,如《景岳全書》所言:“肺出氣也,腎納氣也,故肺為氣之主,腎為氣之根?！币虼嗽谥委烠VA時,不僅要著重針對患者的肺部進行治療使肺主呼吸功能恢復,也應改善患者腎氣使腎主納氣功能正常。

現代醫學在臨床中治療CVA患者多以抗炎、擴張平滑肌、改善支氣管痙攣等藥物為主,但由于受到小兒患者對藥物的耐受性以及藥物所帶來的副作用等因素影響,許多醫者考慮運用中醫學指導思想進行治療,也可緩解西藥帶來的毒副作用從而提高小兒患者生活質量[7-8]。針刺療法[23-24]是在中醫學的指導下把針根據不同的穴位,按照一定的深度、角度刺入患者皮下,然后用相應的捻轉、提插手法作用針體,從而刺激人體特定部位和穴位從而達到治療疾病的目的。針刺治病歷史悠久,臨床運用十分廣泛,其治療效果好,且治療安全無副作用等特點被國內外工作者廣泛接受運用[25-28]。韓建等[29]研究發現,針刺能通過多靶點作用,有效抑制炎癥反應、改善肺功能。李雙等[30]研究發現針刺可降低哮喘大鼠氣道膠原沉積,減輕氣道的炎癥反應,且可以降低血清及肺泡灌洗液中Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白的含量,進而有效改善哮喘大鼠氣道重塑的程度。因此本研究中依據中醫學“肺出氣也,腎納氣也,故肺為氣之主,腎為氣之根”理論,選取針刺肺俞、腎俞穴作為干預方法,并結合既往學者對于與哮喘發生有關的氣道炎癥、氣道膠原沉積的相關研究進行拓展,深入剖析針刺肺俞、腎俞穴對咳嗽變異性哮喘大鼠 MMP-9和TIMP-1表達的影響,進而明確針刺治療CVA的機制,最終為臨床運用針刺治療CVA提供理論與實驗依據。

本次研究中發現,治療組大鼠咳嗽次數、炎性反應程度、組織受損程度以及膠原沉積顯著低于模型組,且治療組大鼠MMP-9和TIMP-1的表達也顯著低于模型組,說明針刺肺俞、腎俞穴可能通過抑制 CVA大鼠MMP-9和TIMP-1的表達,減少肺組織膠原沉積程度,減輕炎癥反應,改善肺組織形態,降低CVA大鼠咳嗽次數,從而促進CVA的恢復。然而,針刺是如何抑制CVA大鼠MMP-9和TIMP-1的表達,是否涉及到相關信號通路,亦或是影響了哪些趨化因子的遷移等,都值得本課題組做出更進一步的研究。