耐萬古霉素腸球菌耐藥基因、轉座子結構和多位點序列分析

王婧婧， 吳林清， 陳如壽， 王玉豐

（1.三亞中心醫院檢驗科，海南 三亞 572000；2. 三亞中心醫院骨科，海南 三亞 572000）

腸球菌（Enterococcus）是醫院感染的常見條件致病菌。近年來，耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）感染率逐年上升，7%～10%的菌血癥由腸球菌感染引起[1-2]。VRE可引起人體多部位感染，主要是廣譜抗菌藥物選擇性的結果。VRE可通過血液感染或定植生長方式進行直接傳播，也可通過食物、醫療器械、污染環境、醫護人員接觸等方式間接傳播[2-5]。VRE包括耐萬古霉素屎腸球菌和耐萬古霉素糞腸球菌，有明顯的耐藥性，涉及VanA、VanB、VanD、VanM和VanN等表型，其中VanA、VanB表型最為常見[5]。了解VRE的耐藥基因、毒力基因、轉座子結構和多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等分子流行病特征，對VRE的防控和治療有重要價值。本研究擬探討92株VRE臨床分離株的耐藥基因、轉座子結構和MLST型別，為有效防治VRE提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

選取2017年6月—2020年6月三亞中心醫院分離自臨床樣本的耐萬古霉素屎腸球菌80株和糞腸球菌株12株。所有菌株分離后均保存在-80 ℃冰箱。

1.2 儀器與試劑

VITEK MS微生物鑒定系統、VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司），ABI 7500 PCR儀（美國ABI公司），PowerPac basic電泳儀（美國伯樂公司），chemolum 8300凝膠紫外成像分析系統（德國Biometra公司）。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測序由北京擎科生物科技公司完成。微量肉湯稀釋法微生物藥物敏感性試驗試劑（溫州康泰生物公司），M-H瓊脂平板、質控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定和細菌耐藥性、表型鑒定 將保存在-80℃冰箱中的菌株進行復蘇，用一次性接種環取出1粒磁珠置于M-H瓊脂平板上進行劃線接種，培養18～24 h后，挑取單個菌落，在靶孔中涂勻，在靶點上加入1 μL基質液，待靶板完全干燥后，采用VITEK MS微生物鑒定系統鑒定菌種；采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀測定菌株對萬古霉素、氨芐西林、青霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環素、替加環素、利奈唑胺、鏈霉素、慶大霉素、奎奴普丁-達福普汀、呋喃妥因的藥物敏感性，嚴格按照儀器說明書要求進行操作，根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019年抗微生物藥物敏感性試驗的執行標準進行藥物敏感性判定。采用微量肉湯稀釋法測定92株VRE對萬古霉素和替考拉寧的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），以MIC≤4 μg/mL為敏感，8～16 μg/mL為中介，≥32 μg/mL為耐藥；若結果為中介，則將菌液劃線于M-H瓊脂平板，培養24 h后觀察是否有菌落生長，如萬古霉素MIC>64 μg/mL，替拉考寧MIC≥32 μg/mL，可判斷為VanA表型。

1.3.2 耐藥基因型測定 提取腸球菌基因組DNA，采用PCR進行萬古霉素耐藥基因檢測，萬古霉素耐藥基因引物包括：vanA（正向引物5'-CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA-3'，反向引物5'-CCCCTTTAACGCTAATACGATC AA-3'，1 030 bp），vanB（正向引物5'-GTGAC AAACCGGAGGCGAGGA-3'，反向引物5'-CCG CCATCCTCCTGCAAAAAA-3'，433 bp），vanD（正向引物5'-TAAGGCGCTTGCATATACC G-3'，反向引物5'-TGCAGCCAAGTATCCGGT AA-3'，461 bp）。反應條件為：95 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 30 s退火；55 ℃ 30 s延伸，72 ℃ 30 s延伸，35個循環；72 ℃ 7 min延伸，陽性產物送華大基因公司進行測序。

1.3.3 VRE毒力基因檢測 腸球菌毒力基因包括hyl、gelE、ace、efaA、asal、esp和cylA，采用多重PCR檢測VRE的毒力基因型分布特征和頻率，參照文獻[6]設計引物和反應條件，擴增后進行測序鑒定。

1.3.4 轉座子結構分析Tn1546基因片段引物包括orf1、orf2-vanR、vanS-vanH、vanR-vanS、vanY-vanZ、vanX-vanY、vanH-vanA-vanX等管家基因引物，參照文獻[5]進行引物合成，PCR擴增后進行測序鑒定。

1.3.5 MLST檢測 分別對屎腸球菌（adk、atpA、ddl、gyd、gdh、purK和pstK）和糞腸球菌（gyd、pstS、gki、xpt、aroE和yiqL）的管家基因進行擴增和測序，反應條件和引物序列設計參照MLST網站（http：//www.pubmlst.org），對PCR陽性產物進行測序，基于MLST數據庫和eBURST V3軟件進行序列和克隆復合群序列比對分析。

2 結果

2.1 VRE菌落生長情況、抗菌藥物敏感性及耐藥表型結果

VRE在培養皿內形成表面光滑、不透明、灰白色的圓形菌落，革蘭染色涂片鏡下觀察可見單個、短鏈狀或成對排列，VITEK MS微生物鑒定系統鑒定結果為80株屎腸球菌和12株糞腸球菌。體外藥物敏感性試驗結果顯示，屎腸球菌和糞腸球菌對萬古霉素的耐藥率均為100.0%，對氨芐西林的耐藥率分別為97.5%和50.0%，2種腸球菌對青霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環素、替加環素、利奈唑胺、鏈霉素、慶大霉素、奎奴普丁-達福普汀均耐藥，但對呋喃妥因較為敏感。92株腸球菌對14種抗菌藥物的耐藥性見表1。微量肉湯稀釋法檢測結果表明，92株VRE對萬古霉素和替考拉寧的MIC分別為192～256和32～256 μg/mL，均為耐藥；根據MIC結果，考慮耐藥表型均為VanA表型。

表1 92株腸球菌對14種常用抗菌藥物的耐藥率

2.2 耐藥基因型和毒力基因型檢測結果

PCR擴增結果顯示，92株VRE均為vanA耐藥基因型，未檢測到vanB和vanD耐藥基因型，所有菌株耐藥表型與基因型一致。毒力基因檢測結果顯示，esp基因所占比例最高（82.5%）；hyl、gelE、asal、cy1A、efaA和ace基因分別占42.5%、18.8%、15.0%、10.0%、15.0%和7.5%。80株屎腸球菌毒力基因型主要為esp（23株）、hyl（13株）、esp-hyl（29株）、esp-gelE（5株）、esp-asal（2株）、其他（8株）；糞腸球菌毒力基因型主要為：esp-cylA-gelE-asal-efaA（3株）、esp-ace-cylA-gelE-asal-efaA（2株）、esp-cylA-asal-efaA（2株）、ace-gelE-asal-efaA（2株）、ace-gelE-efaA（2株）、cylA-gelE-asal-efaA（1株）。

2.3 轉座子結構檢測結果

80株耐萬古霉素屎腸球菌和12株耐萬古霉素糞腸球菌可分為A～E 5個型別。A型為orf1基因下游缺失。B型可以分為B1和B2亞型，B1亞型orf1和orf2基因完全缺失，且在vanX和vanY間反向插入IS1216V；B2亞型僅為orf1和orf2基因缺失。C型可以分為C1和C2亞型，C1亞型orf1、orf2和vanY-vanZ基因缺失，且vanX和vanY間反向插入IS1216V；C2亞型為orf1、orf2和vanY-vanZ基因完全缺失。D型為orf1、orf2、vanY-vanZ和vanX-vanY基因完全缺失。E型為orf1、orf2、vanS-vanH和vanR-vanS基因完全缺失，且vanX和vanY間反向插入ISl216V。

2.4 MLST檢測結果

MLST檢測和eBURST軟件分析結果顯示，92株VRE中共檢出7個ST型別：包括ST17（40/92，43.5%）、ST78（30/92，32.6%）、ST203（6/92，6.5%）、ST363（5/92，5.4%）、ST555（4/92，4.3%）、ST1392（4/92，4.3%）、ST1394（3/92，3.3%）；其中ST1392屬于克隆復合體CC192，ST17、ST78、ST203、ST363、ST5557均屬于CC78克隆復合體，而CC192和CC78均源于CC17克隆復合體。

3 討論

腸球菌是動物腸道中的共生菌，也是可引起免疫功能低下患者院內感染的條件致病菌。目前，屎腸球菌和糞腸球菌已對萬古霉素、青霉素和替考拉寧等多種抗菌藥物產生抗性，快速識別耐藥細菌病原體及其特征在感染的防控工作中發揮著重要的作用，為提高對VRE的防控效率，早期預防其院內傳播，必須盡快查明耐藥腸球菌的攜帶者[2，7-8]。激光解吸電離飛行時間質譜可快速鑒定細菌種類，在進行常規微生物分析時，可以識別毒力生物標志物的峰值，而不需要進行額外的分析，也不需要延長培養時間，在臨床微生物研究領域被廣泛應用于細菌鑒定、分類和菌株分型[8-11]。

本研究采用VITEK MS微生物鑒定系統對92株VRE進行菌株鑒定，結果為80株屎腸球菌和12株糞腸球菌。體外藥物敏感性試驗結果顯示，92株腸球菌對14種臨床常用抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，屎腸球菌和糞腸球菌對萬古霉素的耐藥率均為100.0%，對氨芐西林的耐藥率分別為97.5%和50.0%，表明屎腸球菌比糞腸球菌更易產生耐藥性，但2種腸球菌對呋喃妥因均較敏感。本研究體外藥物敏感性試驗結果提示，92株腸球菌對萬古霉素均表現為較高水平的耐藥，微量肉湯稀釋法對VRE菌株進行萬古霉素和替拉考寧的MIC值測定結果顯示，92株VRE均屬于vanA耐藥表型，未檢測到vanB、vanD、vanM和vanN等其他表型，與以往研究結果[1，5-6]一致。攜帶毒力基因的菌株可在細菌間傳播而產生致病性，主要包括esp、hyl、gelE、asal、cy1A、efaA及ace等毒力基因型。本研究發現，VRE菌株以esp毒力基因型所占比例最高（82.5%），80株屎腸球菌以esp-hyl基因組合最常見，有92株，糞腸球菌以多基因組合為主，表明屎腸球菌和糞腸球菌毒力基因譜存在較大差異，但2種腸球菌的毒力基因相似，均攜帶多個基因或基因組合，屎腸球菌多以單一毒力基因為主，推測VRE可能通過不斷獲得新的毒力基因來不斷增強致病性[6，12-13]。

臨床上VRE最為常見的基因型為vanA和vanB型，耐藥基因可進行水平傳播和轉移[4]。本研究通過PCR檢測結果證實了92株VRE均為vanA表型，經測序證實所有菌株均為vanA耐藥基因型，未檢測到vanB和vanD耐藥基因型，與其耐藥表型一致。而相關研究結果顯示，vanA耐藥基因常位于轉座子Tn1546序列上，由轉座子介導的耐藥基因促使其在不同類型的菌株間進行轉移和傳播，可能導致了萬古霉素耐藥菌株的增多[5，14]。轉座子Tn1546是由orf1、orf2、vanS、vanR、vanY、vanZ、vanX、vanH和vanA 9個基因組成的長為10 851 bp的序列，其中vanH、vanA和vanX與低親和力耐藥靶位有關，而轉座子Tn1546與點突變、不同的插入序列和基因缺失產生耐藥基因有關[15]。

本研究發現，80株耐萬古霉素屎腸球菌和12株耐萬古霉素糞腸球菌的Tn1546轉座子序列可分為5型，提示VRE因在這些位點發生基因缺失和插入序列等異質性改變而產生耐藥。

MLST是通過擴增相應菌株的多個管家基因內部的序列，并進行測序來檢測管家基因是否發生菌株變異的分型方法。菌株的每個管家基因均根據其發現的時間順序來進行等位基因命名，也就是該菌株管家基因譜的ST序列，MLST目前被廣泛用于細菌群體生物學、進化和流行病學的研究中[1，5]。本研究在92株VRE中共發現7個ST型別，以ST17型和ST78最為常見，均屬于CC17克隆復合體，其中ST17型是目前最為流行的VRE的ST型別，其次是ST78型。CC17克隆復合群是VRE在不斷適應環境的過程中逐漸進化形成的，可在醫院內廣泛傳播。因此，早期發現CC17克隆復合體腸球菌有助于有效控制耐藥菌株的廣泛傳播[1，5]。

綜上所述，VRE已成為院內感染的主要致病菌，臨床上多以屎腸球菌和糞腸球菌為主，2種腸球菌感染模式不同，包括耐藥性、耐藥基因譜、毒力基因譜及其轉座子結構、ST型別等的差異，但2種腸球菌耐藥基因和毒力基因攜帶率均較高，可引起醫院條件性感染。因此，加強對VRE耐藥性的流行病學特征及分子機制研究，對早期預防VRE的傳播具有重要作用。