全基因組拷貝數測序在頸項透明層增厚胎兒遺傳學檢查中的應用價值

羅穎花， 劉百靈， 黃際衛， 王遠流， 曾定元， 唐 寧

[1.柳州市婦幼保健院醫學遺傳科，廣西 柳州 545001；2.柳州市婦幼保健院圍產保健科，廣西 柳州 545001；3.柳州市婦幼保健院中心實驗室（生物樣本庫），廣西 柳州 545001；4.柳州市婦幼保健院婦產科，廣西 柳州 545001]

頸項透明層（nuchal translucency，NT）指胎兒頸后冠狀切面皮膚至皮下軟組織之間的最大厚度，超聲表現為胎兒正中矢狀切頸項后的帶狀無回聲。NT增厚與胎兒異常的關系十分密切，這些異常包括染色體非整倍體異常、非染色體異常的嚴重畸形及各類罕見的綜合征等[1]。染色體核型分析技術是產前染色體檢測的金標準，但由于該技術分辨率較低，傳統核型分析技術不能檢測出5 Mb以下片段的染色體異常，也不能判斷某些異常染色體，如額外小標記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC）的來源，因此限制了傳統核型分析技術對染色體亞微結構異常的檢出[2]。近年來，基于高通量測序的低深度全基因組拷貝數測序（whole-genome copy number variation sequencing，CNV-seq）技術發展迅速，已逐步被應用于產前診斷。CNV-seq技術具有分辨率高、通量高、成本低的特點，可以解決現階段產前診斷中傳統核型分析技術操作復雜、分辨率低的問題，有效彌補了傳統染色體核型分析的不足[3]。本研究擬通過CNV-seq技術對NT≥3.0 mm的胎兒進行產前診斷，在染色體核型分析的基礎上進行CNV-seq檢測，探討CNV-seq在NT增厚胎兒產前診斷中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—12月柳州市婦幼保健院圍產保健門診就診，早孕期超聲篩查顯示胎兒NT≥3.0 mm的孕婦110例，進行介入性產前診斷（絨毛或羊水取樣活檢術），同時進行染色體核型分析及CNV-seq檢測。納入孕婦均簽署知情同意書。對所有納入孕婦進行隨訪，記錄其妊娠結局。

1.2 超聲篩查NT

超聲檢查前告知孕婦早孕期胎兒超聲篩查的重要性與局限性，并遵循自愿原則，由孕婦自行簽署知情同意書。NT測量在正中矢狀切面上進行，測量胎兒頸后皮膚內緣至脊柱外軟組織的外緣間的最大距離。多次測量后，取測量最大值，以≥3.0 mm為NT增厚。介入性產前診斷穿刺術嚴格按產前診斷管理辦法[4]中的規定進行。

1.3 染色體核型分析

絨毛或羊水取樣操作均嚴格按產前診斷管理辦法[4]中的規定進行，所獲取的絨毛或羊水進行細胞培養后，以G顯帶染色（必要時加做C顯帶或N顯帶染色）制備染色體樣本，每例標本按照人類細胞遺傳學國際命名體制（the International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）2016年標準，油鏡下分析20個分散程度好、中等長度的中期分裂相，發現嵌合體或異常核型時加數到100個分裂相[5]。

1.4 CNV-seq檢測

1.4.1 提取絨毛或羊水基因組DNA 采用基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取基因組 DNA，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4.2 DNA文庫構建 采用Bioruptor NGS UCD-600非接觸式超聲波破碎儀（比利時Diagenode公司）將提取的基因組DNA打斷成小片段核酸。以打斷后的基因組DNA為起始模板，構建文庫，采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的方法進行富集。采用磁珠純化方法對PCR擴增后的DNA文庫進行純化，從而得到DNA小片段文庫。

1.4.3 測序 將構建好的DNA文庫通過NextSeq500測序平臺（美國Illumina公司）進行測序，最小精度為100 kb，測序深度為1×。

1.4.4 生物信息學分析 將高通量測序結果經信息分析，以hg19為參考序列，用Burrows-Wheel算法（英國劍橋桑格研究院）過濾無比對結果或比對評分低于參考基因組的讀序和重復讀序，保留比對質量高且唯一的讀序（2.8～3.2 Mb）。基因組拷貝數為2.9～3.1判定為重復，基因組拷貝數為0.9～1.1判定為缺失。通過檢索基因組拷貝數變異（copy number variation，CNV）國際數據庫（UCSC、DECIPHER、OMIM、ClinVar）、正常人基因組變異數據庫（DGV）、PubMed數據庫及查閱文獻，根據中國遺傳協會遺傳咨詢分會及美國醫學遺傳協會對CNV的推薦指南進行CNV臨床意義的判定[3，6]。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

110例胎兒NT增厚的孕婦樣本中，NT厚度為3.0～11.7 mm，檢出染色體核型異常26例，檢出率為23.6%（26/110），其中25例染色體非整倍體異常，包括21三體14例、18三體5例、13三體1例，45，X 4例{嵌合體2例[45，X（30）/46，XY（6）、45，X（4）/46，XY（32）]、47，XN，+2[18]/46，XN[82] 1例、47，XN，+mar[84]/46，XN，[21] 1例}。

2.2 CNV-seq檢測結果

CNV-seq檢出異常36例，檢出率為32.7%（36/110），包含染色體核型異常26例。CNV-seq檢出了染色體核型分析未能檢出的3例染色體微缺失及7例微重復，其中7例為臨床意義未明變異，3例為可疑致病性變異。見表1、表2。

表1 不同NT厚度核型分析及CNV-seq檢測結果

表2 10例染色體微缺失/重復的CNV-seq檢測結果及孕婦妊娠結局

通過C N V-seq檢測明確定位染色體核型分析發現的1例胎兒攜帶的sSMC來源于12 p13.33-p11.1，重復片段長度為34.66 Mb，具體區域為seq[hg19]dup（12）（p13.33p11.1）（mos） chr12：g.160001_34820000dup，嵌合比例達20%，嵌合比例與核型分析基本一致，見圖1。對此例胎兒的父母進行了染色體核型檢查，均未見異常。

圖1 異常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21]及CNV-seq檢測結果

續表2

3 討論

NT檢查是早期發現胎兒異常的一種有效的影像學方法，NT增厚提示胎兒發生異常的可能性升高。WESTIN等[7]的研究結果顯示，當NT≥3 mm時，胎兒發生嚴重或致死性畸形的可能性是NT正常者的15倍，胎兒染色體異常的風險隨NT厚度的增加而升高。當NT厚度為3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>8.5 mm時，染色體異常的發生率分別為7%、20%、50%、75%[8]。

本研究結果顯示，在110例胎兒NT增厚的孕婦中，CNV-seq檢出異常36例，檢出率為32.7%。胎兒NT厚度為3.0～3.4、3.5～4.4、4.5～6.4、>6.4 mm時，染色體異常率分別為27.3%（12/44）、32.4%（12/37）、35%（7/20）和55.6%（5/9），提示NT厚度的增加與胎兒染色體異常的發生率有關。對于26例染色體核型分析異常的孕婦，CNV-seq及染色體核型分析的檢出率均為100%，但其中1例胎兒的sSMC采用染色體核型分析只能發現數目增加，無法判斷標記染色體的來源及片段長度；而采用 CNV-seq檢測可確定該異常核型47，XN，+mar[84]/46，XN[21] 中sSMC來源于12 p13.33-p11.1（34.66Mb，嵌合比例為20%），父母既往身體健康，無特殊面容，無家族性遺傳病史，染色體核型未見異常，此sSMC可能為新發變異。12p重復綜合征可引起面部異常、不同程度的發育遲緩和智力障礙、張力減退、聽力喪失及其他系統性異常，在新生兒中的發生率為1/50 000[9-10]。孕婦經遺傳咨詢后于孕13+2周終止妊娠。雖然sSMC在產前診斷中的檢出率較低，但一旦發生，需要結合夫妻雙方染色體核型、胎兒超聲結構異常和不良孕產史，通過細胞遺傳學及CNV-seq或基因芯片檢測結果進行明確診斷，準確判斷sSMC的性質、來源和致病性對sSMC的產前遺傳咨詢和妊娠結局選擇具有非常重要的臨床意義[11]。

本研究結果顯示，CNV-seq檢出了染色體核型分析未能檢出的3例染色體微缺失及7例微重復，由表1可見，1號樣本CNV-seq檢測結果為seq[hg19]del（12）（q21.1q21.2） chr12：g.73240001_76520000del，包含11個基因。RAJAKULENDRAN等[12]在一個家系中檢測到3例12q21.1缺失患者，先證者主要的臨床表征為運動功能發育遲緩、認知障礙、短頭畸形、特殊面容、語言缺乏、髓鞘形成延遲等，先證者兄弟主要的臨床表征為語言功能發育遲緩、學習困難、平衡力差、眼球震顫、輕度肢體共濟失調等，先證者母親主要的臨床表征為發育遲緩、語言功能發育遲緩、眼球震顫、輕度肢體畸形等。DECIPHER數據庫收錄了2例該缺失片段患者，其中1例患者（Patient 290009）的主要臨床表征為智力障礙、身材矮小；另1例患者（Patient 261582）的主要臨床表征為自閉癥、球形鼻、聽覺過敏、牙齒發育不全、上腭狹窄、女性性早熟等。12q21.1q21.2微缺失與認知、語言、運動、學習等發育密切相關，此類影響無法通過產前影像學檢查進行判斷，通過CNV-seq分析可以對胎兒出生后的生長發育情況進行預判，克服影像學檢查在認知、語言等發育方面的局限性，從而對胎兒父母進行優生優育指導。本研究表1中的1號樣本經CNV-seq分析后，胎兒父母在了解胎兒生長發育的風險后選擇終止妊娠。表1中的2號樣本CNV-seq檢測結果為seq[hg19]del（15）（q11.2） chr15：g.22760000_23100000del缺失0.34Mb，包含基因有TUBGCP5、NIPA1、LOC283683、CYFIP1、NIPA2。COX等[13]發現的1例15q11.2（chr15：22821537-23085400，hg19）缺失患者的主要臨床表征為動脈導管未閉、卵圓孔未閉、近端食管閉鎖、遠端氣管食道瘺（C 型）、輕度漏斗胸、母親孕期羊水過多等，該區域缺失患者臨床表型多樣，且存在外顯不全的情況。本研究中的2號樣本對應的胎兒產前未觀察到與文獻報道[13]類似的癥狀，查詢OMIM數據庫，發現該胎兒缺失區域包含痙攣性截癱6（OMIM 600363）的致病基因NIPA1。NIPA1的點突變可導致痙攣性截癱6，為常染色體顯性遺傳，胎兒出生后存在患此病的風險，建議胎兒父母進行CNV檢測，以明確胎兒此變異的來源，進一步明確其致病性，但胎兒父母不同意檢測，并堅持繼續妊娠，孕婦于孕38+4周時剖宮產娩出1名男嬰，體質量為2.9 kg，出生后亦未發現與文獻報道[13]類似的癥狀及痙攣性截癱，其后期生長發育情況有待進一步追蹤。表1中3號樣本的CNV-seq檢測結果為seq[hg19]dup（22）（q11.21）chr22：g.18940001_21800000dup，重復2.86 Mb區域，覆蓋了22q11微重復綜合征的全部區域，22q11微重復綜合征存在外顯不全的情況，患者臨床表型從正常或輕微異常到嚴重，變化幅度較大；最常見的臨床癥狀有：智力障礙（97%）、精神運動發育遲滯（67%）、生長受限（63%）、肌張力低下（43%）、說話鼻音重（44.4%）等[14]。盡管存在外顯不全的情況，大部分22q11微重復還是存在輕重不一的表型，與其相關的智力、精神、運動發育問題在出生后才逐步顯現。本研究中3號樣本對應的孕婦經CNV-seq分析和遺傳咨詢，在了解胎兒生長發育的風險后選擇終止妊娠。

本研究表1中的4～10號樣本采用CNV-seq檢測，發現存在染色體微缺失/重復，其中4號樣本8q21.12q21.13缺失4.58 Mb，包含21個基因，其中PMP2是腓骨肌萎縮征（OMIM：618279）的致病基因，為常染色體顯性遺傳，胎兒出生后存在患此病的風險，建議胎兒父母進行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進一步明確其致病性，但胎兒父母不同意檢測并堅持繼續妊娠，于孕38+3周順產1名男嬰，體質量3.0 kg，其后期生長發育情況有待進一步追蹤。5號樣本8q12.1q12.3重復1.66 Mb，包含6個基因，其中包含CHD7基因（OMIM 608892）的全部，該基因的突變與CHARGE綜合征相關，為常染色體顯性遺傳，目前尚無CHD7基因重復導致CHARGE綜合征的報道，該變異致病性未明，建議胎兒父母進行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進一步明確其致病性，孕婦選擇終止妊娠，但未進一步檢測。6號樣本5q23.2重復1.4 Mb，包含6個基因，其中ALDH7A1是常染色體隱性遺傳癲癇的致病基因，其余5個基因的功能不明確，該變異致病性未明，建議胎兒父母進行CNV檢測以明確胎兒此變異的來源，進一步明確其致病性，孕婦選擇終止妊娠，但未行進一步檢測。

對于本研究表1中7～10號樣本的CNV，通過檢索UCSC、DECIPHER、ClinVar、DGV、PubMed等數據庫及查閱文獻，均未見相關報道。在包含的基因中未發現與疾病密切相關的基因，因胎兒父母未同意進行CNV檢測，胎兒的CNV來源不明。胎兒出生后的生長發育情況是否與CNV有關還有待進一步追蹤，其臨床意義有待進一步明確。

綜上所述，NT檢測是早期產前篩查發現胎兒異常的一種有效方法[15]，結合染色體核型分析及CNV檢測能有效提高染色體異常的檢出效率。染色體核型分析及CNV檢測能覆蓋大部分染色體的異常。CNV-seq檢測雖然不能檢測染色體平衡易位、倒位，但可檢測染色體微缺失/重復、sSMC，提高了對染色體異常的檢測水平，可獲得更多的遺傳學信息，為NT增厚評估及遺傳咨詢提供更優的參考。