基于NLRP3炎癥小體探討天麻鉤藤顆粒對自發(fā)性高血壓肝陽上亢證認(rèn)知障礙的影響*

劉晨笑，孟玥，孫治琪，趙永烈，劉子旺

北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

隨著人們生活節(jié)奏的加快，不規(guī)律的生活和飲食方式使得高血壓發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的高血壓是引起認(rèn)知功能障礙的主要危險(xiǎn)因素，對學(xué)習(xí)、記憶、執(zhí)行等方面的認(rèn)知功能造成不同程度的損害［1］。中醫(yī)學(xué)將高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”等范疇，以肝陽上亢證最為常見［2］。臨床上，中醫(yī)準(zhǔn)確的辨證論治收效明顯，但其作用機(jī)理尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立肝陽上亢型高血壓認(rèn)知功能障礙模型，通過檢測模型大鼠血壓、認(rèn)知行為學(xué)、血清炎性因子及額葉病理損傷，探究天麻鉤藤顆粒防治高血壓認(rèn)知功能障礙可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）32只，清潔級，雄性，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g；清潔級SD大鼠6只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012－0001，倫理批號：BUCM－4－2019092402－3070。實(shí)驗(yàn)室定期清潔、消毒，通風(fēng)良好，溫度20～25℃、濕度（55±2）%，晝夜間斷照明。

1.2 藥物與試劑附子湯（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房提供）；天麻鉤藤顆粒（成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批號：20200609）；尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：20190207）。戊巴比妥鈉（天津市元立化工有限公司，批號：20190506）；無水乙醇、二甲苯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號分別為：BH100591、20191208）；蘇木素染液（上海碧云天生物公司，批號：190916）；伊紅（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號：190917）；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotides bind to oligomeric domain－like receptor 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis－associated spot－like protein，ASC）、Caspase－1試劑盒（武漢圣洛捷生物技術(shù)有限公司，貨號分別為：AE31893HU、AE58604HU、AE38730HU）。

1.3 儀器Softron BP－2010A型大鼠無創(chuàng)尾動脈測壓儀（北京軟隆科技有限責(zé)任公司）；ZS－001moriss型水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio－tek公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備附子湯制備方法：制附子（黑順片）浸泡30 min，煎煮兩次，將兩次藥液合并濃縮為含生藥量0.2 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

臨床上患者每天服用天麻鉤藤顆粒為30 g，尼莫地平片為60 mg。按照大鼠與人為6.25換算系數(shù)，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)大鼠天麻鉤藤顆粒灌胃劑量為3.125 g·kg－1，尼莫地平片灌胃劑量為6.25 g·kg－1。用蒸餾水把天麻鉤藤顆粒配制成31.25 g·mL－1藥液，尼莫地平片配制成62.5 g·mL－1藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物模型制備及分組將32只SHRs大鼠，隨機(jī)取8只作為自發(fā)性高血壓組，其余大鼠連續(xù)給予附子湯（2 g·kg－1）28 d，復(fù)制自發(fā)性高血壓肝陽上亢證大鼠模型［3－4］，然后將其分為SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組，另取6只正常SD大鼠為空白組，分別給予相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃42 d，空白組、對照組均給予同體積的蒸餾水42 d。

2.3 觀察大鼠的一般情況

2.3.1 大鼠的表觀指標(biāo)觀察大鼠毛發(fā)是否粗糙發(fā)黃、蓬松無光澤，形體是否消瘦，眼結(jié)合膜是否充血、顏色等。大鼠給藥后進(jìn)行測定。

2.3.2 易激惹程度評分的測定Ⅰ級：抓取大鼠頸部時狂躁、驚叫，為1分；Ⅱ級：抓取大鼠頸部時惱怒、傷人，有攻擊性，為2分；Ⅲ級：提捏大鼠尾部時驚叫、狂躁，同籠內(nèi)大鼠打斗激烈、撕咬鼠籠、傷人，攻擊性較強(qiáng)，為3分；無明顯現(xiàn)象記0分。大鼠于給藥后測量1次。

2.3.3 大鼠飲水量的測量將全部大鼠予單籠飼養(yǎng)，選擇帶有刻度值的250 mL專用滾珠型飲水瓶供水，觀察24 h飲水量變化，飲水瓶內(nèi)水量變化加每日灌藥量即為每日飲水量。大鼠于給藥后測量1次。

2.4 Morris水迷宮的測試給藥第38天后，大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，共3 d，訓(xùn)練大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，第4天記錄大鼠在各象限入水點(diǎn)入水后找到平臺的時間（逃避潛伏期）。具體操作：將大鼠面朝壁分別于四個象限的入水點(diǎn)放入水迷宮內(nèi)，觀察并記錄找到平臺的時間；第4天撤去平臺，將大鼠于平臺對側(cè)入水點(diǎn)放入，觀察大鼠游泳軌跡并記錄60 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限穿越平臺區(qū)域的次數(shù)，測試大鼠空間記憶能力。

2.5 血壓的測量水迷宮測試后對大鼠測量血壓，每只大鼠在靜息狀態(tài)下測量3次，取平均值。

2.6 血清指標(biāo)的檢測血壓測量后，用體積分?jǐn)?shù)5%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，腹主動脈血，4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，分離血清后，采用ELISA法檢測血清中NLRP3、Caspase－1、ASC水平。

2.7 觀察大鼠腦病理損傷變化腹主動脈取血后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，剝離大腦額葉組織，40 ng·L－1多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，厚5μm，每片相距30μm，常規(guī)脫蠟后蘇木精－伊紅染色，封用。在顯微鏡下觀察大鼠腦病理損傷變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用配對樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況空白組、對照組毛發(fā)柔順光澤、形體正常、眼結(jié)合膜無充血；SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)蓬松無光澤、形體消瘦、眼結(jié)合膜充血等。與空白組、對照組比較，SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠易激惹程度評分和飲水量均顯著增加（P＜0.01）。見表1。

表1 對大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

表1 對大鼠易激惹程度和飲水量的影響（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△△P＜0.01

組別 n易激惹程度評分／分 飲水量（V／mL）6 0.83±0.41 24.71±1.57對照組 8 1.50±0.76 24.51±2.04 SHRs肝陽上亢證組 8 2.38±0.52**△△46.24±2.56**△△天麻鉤藤顆粒組 8 2.38±0.52**△△46.93±2.23**△△尼莫地平片組 8 2.5±0.53**△△47.33±3.09空白組**△△

3.2 對大鼠水迷宮測試的影響與空白組、對照組比較，SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限停留時間明顯縮短、穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與SHRs肝陽上亢證組比較，天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限停留時間明顯延長、穿越平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見表2、圖1、圖2。

表2 對大鼠水迷宮測試的影響 （±s）

表2 對大鼠水迷宮測試的影響 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃P＜0.05

組別 n逃避潛伏期（t／s）目標(biāo)象限停留時間（t／s）穿越平臺次數(shù)／次6 25.99±3.28 34.04±1.77 5.58±1.26對照組 8 26.74±2.42 32.36±3.12 5.02±1.52 SHRs肝陽上亢證組8 42.96±5.91*△24.22±2.67*△ 3.00±1.13*△天麻鉤藤顆粒組 8 29.62±5.65*△＃27.87±2.46*△＃4.99±1.16*△＃尼莫地平片組 8 30.40±3.52*△＃28.03±2.55*△＃5.03±1.09*△＃空白組

圖1 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖

圖2大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖

3.3 對大鼠血壓的影響與空白組比較，對照組、SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著升高（P＜0.01）；與對照組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓顯著降低（P＜0.05）、舒張壓顯著降低（P＜0.01）；與SHRs肝陽上亢證組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠收縮壓、舒張壓均顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 對大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

表3 對大鼠血壓的影響 （±s，mm Hg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃＃P＜0.01。1 mm Hg＝0.133 kPa

組別 n 收縮壓 舒張壓空白組6 116.00±9.63 87.50±3.15對照組 8 193.50±11.82** 140.88±5.74**SHRs肝陽上亢證組 8 205.63±15.95** 137.00±7.96**天麻鉤藤顆粒組 8 183.50±29.44**△＃＃118.50±12.26**△△＃＃尼莫地平片組 8 172.38±22.82**△＃＃117.25±10.76**△△＃＃

3.4 對大鼠血清炎癥因子的影響與空白組比較，對照組、SHRs肝陽上亢證組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著升高（P＜0.01）；與對照組、SHRs肝陽上亢組比較，麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清NLRP3、Caspase－1、ASC水平均顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 對大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

表4 對大鼠血清炎癥因子的影響 （±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SHRs肝陽上亢證組比較，＃＃P＜0.01

數(shù)量 NLRP3（ρ／μg·L－1） Caspase－1（c／nmol·L－1） ASC（ρ／ng·L－1）8.50±0.69 17.37±1.56 73.50±37.57對照組 8 13.78±0.87** 27.61±1.94** 182.35±36.45**SHRs肝陽上亢證組 8 13.33±0.51** 24.10±2.56** 199.02±25.92**天麻鉤藤顆粒組 8 11.39±0.30**△△＃＃ 20.60±1.66**△△＃＃ 114.12±25.39**△△＃＃尼莫地平片組 8 11.28±0.43**△△＃＃ 20.16±3.65**△△＃＃ 125.79±17.67**△△＃＃空白組6

3.5 對大鼠額葉病理學(xué)及尼氏染色的影響空白組、對照組、天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠額葉神經(jīng)元細(xì)胞輪廓清晰，排列規(guī)整、緊密，細(xì)胞核大而圓，處于胞體中心，核仁清晰可見，胞體充盈，細(xì)胞質(zhì)豐富；且天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組分別與空白組及對照組相比無明顯區(qū)別。SHRs肝陽上亢證組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)變性、大小不等及結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核縮小，核仁不清。說明天麻鉤藤顆粒和尼莫地平片能夠抑制神經(jīng)元變性。見圖3、圖4。

圖3 額葉HE染色（200×）

圖4 大鼠腦組織額葉尼氏染色（200×）

4 討論

隨著中國社會老齡化進(jìn)程不斷加快，高血壓的發(fā)病率逐年上升，截止到2017年，高血壓患病率已達(dá)到46.4%［5］，且由高血壓造成的認(rèn)知功能障礙也在持續(xù)進(jìn)行，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［6］。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓是認(rèn)知功能障礙發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［7－9］，高收縮壓（＞160 mm Hg）者血壓每升高10 mm Hg，誘發(fā)認(rèn)知能力減退的風(fēng)險(xiǎn)增加9%［10］。針對高血壓導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，西醫(yī)多予降壓、營養(yǎng)腦神經(jīng)等方法治療，臨床效果較好，但存在不良反應(yīng)，而中醫(yī)則注重調(diào)節(jié)整體，通過辨證論治選方用藥，降壓的同時又能減輕不良反應(yīng)，較西醫(yī)具有顯著優(yōu)勢［11］。

高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”范疇，其中以肝陽上亢證最為常見［2］，認(rèn)知功能障礙則屬“癡呆”“健忘”之類。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多因肝陽偏亢、肝腎陰虛日久，耗傷肝腎陰精，腎精虧虛，髓減腦消，神機(jī)失用，影響認(rèn)知功能。天麻鉤藤飲是臨床治療高血壓的代表方劑，該方出自胡光慈的《中醫(yī)內(nèi)科雜病證治新義》，由天麻、鉤藤、石決明、黃芩、梔子、益母草、牛膝、杜仲、桑寄生、茯神、夜交藤組成，具有平肝潛陽、滋補(bǔ)肝腎之功效，與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头阶C對應(yīng)，并且干預(yù)42 d即可出現(xiàn)相關(guān)癥狀及指標(biāo)的變化［12－13］。研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平脂溶性好，能夠通過血腦屏障，有降壓作用，同時對認(rèn)知功能障礙亦有改善作用［14－15］。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用尼莫地平片作為對照組。

高血壓導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的西醫(yī)發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［16］，“高血壓是一種血管炎癥”這一說法越來越受到醫(yī)者的認(rèn)可［17］，其中NLRP3炎癥小體在高血壓、認(rèn)知功能障礙等疾病發(fā)生進(jìn)程中具有重要作用［18－20］。NLRP3炎癥小體是由NLR蛋白、ASC、半胱氨酸蛋白酶前體（pro－caspase－1）共同組成的一種多蛋白多聚體，受到氧化應(yīng)激、微生物感染、免疫反應(yīng)等危險(xiǎn)因子時被激活形成巨大的炎癥小體復(fù)合物［21］，將Caspase－1前體（pro－caspase－1）剪切為生物活性較強(qiáng)的Caspase－1 P10片段，促使下游白細(xì)胞介素－18前體（pro－interleukin－18，pro－IL－18）和白細(xì)胞介素－1β前體（pro－interleukin－1β，pro－IL－1β）轉(zhuǎn)化成具有較強(qiáng)生物活性的IL－18和IL－1β等炎癥因子［22］，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)膽堿能抗炎通路（cholinergic anti－inflammatory pathway，CRP）、IL－6和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等多種炎癥細(xì)胞因子的成熟與分泌［23－24］。其中IL－18和IL－1β可激活核因子－κB（nuclear factorκB，NF－κB）信號通路，誘發(fā)腦神經(jīng)炎［25］；TNF－α可通過激活T淋巴細(xì)胞引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)或一系列的復(fù)合反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，加重局部炎癥，導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡及腦組織損傷［26］，出現(xiàn)認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)等腦功能障礙。加之長期處于高血壓狀態(tài)下，血管平滑肌增生、內(nèi)皮損傷，血管通透性增加，促使了各種炎癥因子向腦組織的侵入，加重腦組織損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，與SHRs肝陽上亢證組、對照組比較，天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠血清中NLRP3、ASC、Caspase－1水平顯著降低，且天麻鉤藤顆粒組亦低于尼莫地平片組。大腦額葉與認(rèn)知、執(zhí)行能力和情緒處理能力等功能密切相關(guān)［6］，通過觀察大鼠腦額葉病理損傷發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后，除SHRs肝陽上亢證組出現(xiàn)腦皮質(zhì)水腫、神經(jīng)元變性，空白組、對照組、天麻鉤藤顆粒組及尼莫地平片組組間無明顯區(qū)別。結(jié)合Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即干預(yù)后的天麻鉤藤顆粒組、尼莫地平片組大鼠逃避潛伏期縮短、目標(biāo)象限停留時間延長、穿越平臺次數(shù)增多等情況，提示天麻鉤藤顆粒能夠有效改善認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能是通過降低血清中的NLRP3炎癥小體，抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦額葉組織損傷，保護(hù)額葉神經(jīng)元，從而達(dá)到改善認(rèn)知功能的目的。有研究證明了癡呆與炎癥反應(yīng)的關(guān)系［27］，提出額葉皮質(zhì)損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［28］，也有研究證實(shí)天麻鉤藤飲能夠改善自發(fā)性高血壓肝陽上亢證所致的認(rèn)知功能障礙［29－30］，均支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

綜上所述，天麻鉤藤顆粒能在一定程度上抑制NLRP3炎癥小體合成，保護(hù)額葉神經(jīng)元，改善模型大鼠認(rèn)知能力，這可能是其治療高血壓認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制。