豨桐丸治療類風濕性關節炎的分子作用機制研究*

莊嚴，王少佩，王永林，胡玉龍，仝艷，董春紅，李曉飛

河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）在中醫學中稱為“痹證”，是由于人體自身正氣不足受到外邪后，氣、血、津液、經絡凝滯不通而導致的［1－10］。盡管現有藥物對RA的療效確切，但不良反應明顯［11］。因此，探尋有效且不良反應小的中藥方劑具有重要意義?！稘鲤B生集》卷三中記載豨桐丸具有“祛風勝濕、舒筋活絡之功效。主治感受風濕、兩足酸軟、步履艱難、狀似風癱”。該方由臭梧桐葉及豨薟草等量調劑而組成?！缎滦薇静荨分杏涊d“豨薟草，辛、苦、寒，有祛風濕、利關節、解毒之功效”；《本草圖經》中記載“臭梧桐葉，藥性辛、苦、甘、涼，歸肝經，祛風濕、通經絡、平肝”?，F代臨床應用中，豨薟草常被應用于治療風濕痹痛、中風半身不遂、四肢麻木、腰膝酸軟［12］等；臭梧桐葉被應用于治療風濕痹癥［13］，兩者相須為用，臨床主要用于治療風濕、RA及其相關病癥，尚未有不良反應的報道。研究表明，豨桐丸通過抑制炎性介質來治療RA［14］，但無分子水平上的治療機制研究。本研究運用分子對接、分子動力學，結合網絡藥理學研究豨桐丸活性成分與RA相關靶蛋白的結合模式和結合能，探究豨桐丸治療RA的物質基礎，通過單成分－多靶點、多成分－單靶點、單成分－單靶點的作用分析，探討了豨桐丸活性成分與RA相關靶蛋白的作用機制，從豨桐丸的活性成分中篩選出可能用于治療RA的關鍵成分，為進一步的藥物設計與研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 豨桐丸活性成分數據庫的建立臭梧桐葉的提取物含有多種化學成分。王昭［15］把臭梧桐葉的化學成分分為六類：揮發油類，共5種，分別為1－己醇、伽羅木醇、2，6，10，15－四甲基十七烷、5－甲基－3－庚酮和2，6，6－三甲基環己酮；黃酮類，共8種，分別為芹菜素、芹菜素－7－葡萄糖醛酸、車前草苷、臭梧桐素、海常素、海州常山苷、刺槐素－7－二葡萄糖醛和金合歡素－7－二葡萄糖醛酸；還有苯丙素類、生物堿類、糖苷類和其他類。宋婷［13］、Kim KM等［16］發現，豨桐丸中含有的苯丙素類化合物有異青角甾苷、毛蕊花糖苷和去咖啡酰毛蕊花糖苷，還發現了其他苯丙素類化合物咖啡酸甲酯、去鼠李糖洋丁香酚苷、去鼠李糖異洋丁香酚苷、3，4－二羥基苯乙醇［17］、1－O－咖啡苷、洋丁香酚苷、異洋丁香酚苷、地黃苷和異地黃苷［18］；生物堿類化合物有常山堿、常山定堿和異常山定堿［19］。胡海軍等［20］采用石油醚對臭梧桐葉進行萃取得到了羽扇豆醇、木栓酮、白樺脂酸、蒲公英賽酮、赪桐甾酮等有機物質。徐瑞蘭等［21］從臭梧桐葉提取分離了11種化學成分：β－谷甾醇、β－胡蘿卜苷、芹菜素、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯、乙酸橙酰胺、類葉升麻苷、馬替諾皂苷、5－羥甲基糖醛、corchorifalty酸E、單棕櫚酸甘油和正葵醇。結合中藥系統藥理學數據庫和分析平臺［22］（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）及文獻報道，最終歸納得到了豨薟草共31種化學成分。

參考擴大范圍的類藥五原則，以相對分子質量＜700，氫鍵給體數＜5，氫鍵受體數目＜10，酯水分配系數＜5，以及口服生物利用度（oral bioarailability，OB）≥20%和類藥性（drug－likeness，DL）＞0.10作為篩選依據，分別從臭梧桐葉和豨薟草成分中篩選（并刪重）得到39個化合物（表1）。采用Chem 3D軟件構建所有小分子的三維結構，采用MM2分子力學方法進行幾何優化，優化后的結構即為分子對接的小分子初始構象。

表1 豨桐丸的39種化學成分結構

續表1 豨桐丸的39種化學成分結構

1.2 靶蛋白數據庫的建立

研究表明，多種酶參與了RA的發生。非受體型酪氨酸激酶JAK1及JAK3可與炎癥因子白細胞介素結合，導致RA炎癥癥狀，因此選擇性抑制JAK1及JAK3的活性治療RA［23］；受體酪氨酸激酶Syk使下游的核因子－κB（neclear factor kappa B，NF－κB）活化，最終上調內皮細胞間黏附分子－1（intercelular adhesion molecule－1，ICAM－1）導致RA的發生；Yeh等［24］研究表明，與RA炎癥相關的轉錄因子，如AP－1、NF－κB及信號轉導和轉錄活化因子的活性直接或間接地受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路的調控，而MAPK激酶1（MEK1）能夠將MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化，使之激活，將信號轉導通路上游的信號整合到MAPK，從而調節多種細胞因子的合成和促進破骨細胞分化，從而發生了RA。因此，本研究選擇p38 MAPK［25－26］、JAK1和JAK3［25］、Syk［26］、MEK1等5種酶建立RA靶點數據庫，其3D結構從RCSB PDB數據庫（https：／／www.rcsb.org／）下載（PDB ID分別為：1OUY、4K6Z、3ZC6、4PUZ、1S9J）。采用Autodocktools 1.5.6軟件［27］刪除晶體中多余的小分子、結晶水，為蛋白分子添加氫原子、gasteiger電荷。

1.3 分子對接

1.3.1 參數設置分子對接方法采用AutoDock 4.2程序［28］。構象搜索采用拉馬克遺傳算法，群體規模：150；能量最大評估數：2 500 000；最大遺傳代數：27 000；獨立運行次數：10次。其余參數均為默認設置。

1.3.2 方法可靠性驗證為了驗證autodock程序對本研究中對接體系的可靠性［29］，分別將5種靶蛋白復合物的原有配體抽離，再重新對接到復合物的活性口袋，并計算對接后配體的構象與原始晶體結構中配體構象的均方根偏差值（root－mean－sguare deviation，RMSD）。一般認為當RMSD值≤2.0?時，證明該對接方法可以較好地重現配體受體原來的結合模式，對接參數設置合理［30］。

1.4 分子動力學模擬為了驗證小分子與蛋白對接結果的合理性和穩定性，參考Jacob D Durrant等［31］提出的模擬方法，對對接結合能低的化合物和相關靶蛋白的對接復合物進行了進一步的分子動力學模擬與分析。

分子動力學采用Amber18進行，大分子采用AMBER ff14SB力場，小分子采用GAFF力場［32］。在HF／6－31＋G（d）水平下，運用Gaussian 09軟件對小分子進行能量優化，并添加resp電荷。溶劑模型選擇TIP3P，將蛋白置于立方體水盒子中，盒子邊緣與蛋白分子距離為10?，添加抗衡離子使體系保持電中性。經過以下步驟使體系達到平衡：①限制蛋白分子，優化溶劑分子。共4 000步，其中前2 000步應用最陡下降法，后2 000步使用共軛梯度法優化；②限制蛋白中重原子的位置的優化。共5 000步，前2 500步采用最陡下降法，后2 500步采用共軛梯度法優化；③不加約束力整體優化。共10 000步，前5 000步應用最陡下降法，后5 000步應用共軛梯度法；④60 ps的升溫過程：0～50 ps內將系統溫度從0 K逐漸升至310 K，50 ps～60 ps達到恒溫310 K；⑤50 ns動力學模擬：采用NPT系統，時間步長設為2 fs。

1.5 網絡藥理學分析

1.5.1 成分靶點篩選在TCMSP數據庫（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）中以OB≥20%，DL＞0.10為條件，篩選出豨薟草的化學成分，同時搜集成分對應的靶點信息；從Swisstargets數據庫（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）中檢索豨桐丸4個對接結合能最低的化合物7、11、19、21（見表1）對應的靶點信息。合并刪重后，將兩部分靶點匯總。

1.5.2 疾病靶點篩選以“Rheumatoid Arthritis”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https：／／www.genecards.org／）和NCBI基因數據庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene／term＝）進行檢索。將Genecards數據庫檢索到的基因根據relevance值的中位數進行2次基因篩選。

1.5.3 韋恩圖、蛋白質蛋白質相互作用網絡構建（protein－protein interaction，PPI）網絡構建及拓撲分析篩選出的成分靶點與疾病靶點輸入韋恩圖作圖軟件Venny 2.1，得到藥物與疾病的交集靶點，并將其輸入STRING數據庫（https：／／string－db.org／cgi／input.pl）進行PPI網絡的構建；然后將PPI網絡導入Cystoscape 3.6.0軟件中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以計算度、介度、平均最短距離和緊密度4個拓撲學參數為參考標準。通過度值排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點。將關鍵靶點依次導入DisGeNET數據庫，獲取各靶點對應的蛋白類型。

1.5.4 中藥－成分－疾病靶點網絡構建運用Cytoscape 3.6.1軟件構建藥物－成分－疾病－靶點網絡圖。將1.5.1中篩選得到的靶點與中藥成分進行映射關聯，得到“成分－靶點”關聯表，與PPI網絡共同導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建豨桐丸的“中藥－化合物－靶點”關聯網絡。

1.5.5 MCODE聚類分析通過MCODE分析進行RA治療過程中關鍵基因的篩選。將已經構建的PPI網絡導入Cytoscape 3.6.1軟件，通過MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.5.6 GO富集分析將成分與疾病的共有靶點進行GO富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cell component，CC）富集。采用STRING數據庫，根據P≤0.05進行篩選，使用R 3.6.3軟件進行柱狀圖繪制，選擇BP、MF、CC富集程度的前10條通路作圖。

1.5.7 KEGG通路富集將成分與疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，用STRING數據庫，根據P值≤0.05進行篩選，采用R 3.6.3軟件進行氣泡圖的繪制。

2 結果

2.1 分子對接結果

2.1.1 方法可靠性驗證與晶體結構相比，對接后的5個復合物的RMSD值分別為：1.71、1.78、1.29、1.85、1.05á。5個靶蛋白原始晶體結構中配體構象與對接后配體的構象疊合，見圖1；5個對接后的配體構象與原始晶體結構中配體構象基本重合。疊合構象和RMSD值均表明本分子對接方法和參數設置可靠。

圖1 5個靶點蛋白復合物1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）原始晶體結構中配體的構象與對接后配體的構象疊合對比

2.1.2 豨桐丸化學成分與靶蛋白對接結果以晶體原有配位作為陽性對照，將5個靶點蛋白與豨桐丸的39個成分進行對接，配體與靶蛋白的打分結果（結合能ΔG），見圖2。

圖2 豨桐丸中39個化學成分與靶蛋白1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）的結合能

對豨桐丸中39個小分子與5個靶蛋白的結合能較低的前5個化合物進行統計，共有3、7、10、11、14、17、19、21、29、38、39等11個，頻率排序依次為7（5次）；11、19、21（4次）；38、39（3次）；10、14（2次）；3、17、29（1次）。因此，推測豨桐丸治療RA可能是通過以上化合物對相關蛋白的強抑制作用來實現的。

2.1.3 豆甾醇與5個靶蛋白的相互作用分析（單成分－多靶點作用）對接結果表明，化合物7（豆甾醇）與所有靶蛋白都有較低的結合能，顯示其具有單成分－多靶點的作用。為了進一步分析豆甾醇和相關靶蛋白的作用機制，使用Ligplot軟件［33］對豆甾醇與各靶蛋白對接的復合物的配體－受體相互作用進行分析，見圖3。

2.1.4 4個化合物與靶蛋白3ZC6作用的模式分析（多成分－單靶點作用）化合物7、11、19和21與靶蛋白3ZC6具有較負的結合能，能有效抑制相關靶點，存在多成分－單靶點的作用機制。將化合物7、11、19、21與靶蛋白3ZC6對接的復合物的配體－受體相互作用見圖3（B）和圖4。

圖3 化合物7與1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）的相互作用示意圖

圖4 靶蛋白3ZC6與化合物11（A）、化合物19（B）、化合物21（C）的相互作用示意圖

由2.1.3和2.1.4結果推測，當配體與靶蛋白結合時，非極性相互作用能夠對靶蛋白和配體的結合產生促進作用，即化合物與靶蛋白結合形成較多的疏水作用時，具有較低的結合能，結合更加穩定，有效抑制靶蛋白的活性。因此，小分子與靶蛋白之間主要是通過疏水作用結合來抑制有關酶的活性，從而起到治療RA的作用。

2.1.5 豆甾醇與靶點結合的相互作用分析對接表明，豆甾醇和靶蛋白具有較強的相互作用和活性，豆甾醇由甾體骨架和一個羥基構成，為了驗證其羥基是否對活性起關鍵作用，將其羥基替換為疏水的甲基，再次進行分子對接，結果見表2。從表2可以看出，羥基換成甲基后的化合物與5個靶蛋白的結合能均有所降低，但下降的程度不明顯，表明豆甾醇與靶蛋白的主要結合力來自豆甾醇的碳骨架原子和相關氨基酸殘基的疏水作用，而羥基對結合能的貢獻較弱，并非關鍵活性基團，這為后續該藥物的優化和設計提供了改造思路。

表2 改造前后的豆甾醇與5個靶蛋白對接打分（ΔGbinding，kcal·mol－1）

2.2 分子動力學模擬結果

2.2.1 分子疊合分析為了更直接的觀察豆甾醇與相關靶蛋白相互作用的動力學過程，選取豆甾醇與靶蛋白4PUZ的蛋白復合物，從0 ns開始，每隔5 ns提取一次蛋白構象，共提取10個構象，與初始構象進行疊合，疊合結果見圖5。提示，小分子雖然有構象位置的調整，但中心基本重合，表明二者結合穩定。

圖5 豆甾醇與靶蛋白4PUZ的蛋白復合物構象疊合

2.2.2 RMSD分析以對接結構平衡后的構象為參照，通過分析整體蛋白結構的RMSD在模擬過程中的動態變化，進而考察復合物體系的穩定性。5個靶蛋白的骨架原子和豆甾醇的非氫原子在50 ns內的RMSD變化情況，見圖6。從圖6（B）、圖6（D）和圖6（E）可看出，小分子在平衡的最初期進行了構象的調整，之后達到了穩定。圖6（A）和圖6（C）的小分子在25 ns和30 ns之間構象進行細微的調整后趨于穩定。復合物和大分子的RMSD基本穩定。RMSD值表明豆甾醇和4個靶蛋白結合穩定，實驗對接結果合理可靠。

圖6 豆甾醇與靶蛋白1S9J（A）、1OUY（B）、3ZC6（C）、4PUZ（D）、4K6Z（E）復合物分子動力學軌跡的RMSD分析

2.3 網絡藥理學結果與分析共得到化合物7、11、19、21對應的237個靶點，豨薟草14個活性成分對應的58個靶點，將兩部分靶點刪重匯合共得到284個成分靶點。

2.3.1 RA靶點查找經過檢索，從GeneCards數據庫共檢索到1 067個相關基因，從NCBI基因數據庫共得到1 206個基因。將這兩個數據庫的基因合并刪重之后，得到與RA相關的基因共1 651個。

2.3.2 韋恩圖將篩選出的成分靶點與疾病靶點做出韋恩圖，得到112個交集靶點，作為豨桐丸治療RA的預測靶點，如圖7（A）所示。

2.3.3 PPI網絡構建及拓撲分析PPI網絡的構建見圖7（B），圖中節點表示蛋白，邊表示蛋白間的關聯，度值越大，節點越大，在整個網絡中占有的地位就越大。共篩選出42個關鍵靶點，將前20個靶點使用R 3.6.3繪制拓撲性質如圖7（C）所示。結果表明，豨桐丸治療RA的過程中有白蛋白（ALB）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子（VEGFA）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、SRC原癌基因（SRC）、半胱天冬酶（CASP3）、前列腺素G／H合成酶2（PTGS2）、基質金屬蛋白酶（MMP9）等多種物質。

2.3.4 中藥－成分－疾病靶點網絡構建將篩選得到的112個靶點與豨桐丸成分進行映射關聯，得到13個化學成分的“成分－靶點”關聯表，與PPI互作表共同導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建豨桐丸的“中藥－化合物－靶點”關聯網絡，如圖7（D）所示（藍色：活性化合物；黃色：靶點；紫色：組方中藥；紅色：疾病即RA）。根據度值排序，值越大，成分越重要。其中，谷甾醇（beta－sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、羽扇豆醇（lupeol）、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯（apigenin－7－O－beta－D－glucuronide butyl ester）4種活性成分對應的靶點數目分別為：47、46、40、40，遠高于其它14種活性成分，表明這4種成分是豨桐丸治療類風濕性關節炎的主要活性成分，該結果和分子對接結果完全一致。連接度前6的關鍵靶點基因是PGR、PTGS2、PTGS1、SLC6A4、CYP19A1、DRD2，表明以上的基因可能是豨桐丸治療類風濕性關節炎的關鍵基因。中藥－成分－疾病靶點網絡構建分析表明每個靶點與多個化合物相關聯，豨桐丸在發揮藥效時可同時影響多個關聯的靶點，為開發新的RA藥物和臨床治療研究提供了新的方向。

圖7 豨桐丸“中藥－成分－疾?。悬c”網絡關聯圖構建

2.3.5 MCODE聚類分析通過MCODE分析進行RA治療過程中關鍵基因的篩選，共得到2個基因簇和2個核心基因，核心基因為MAPK、PPARG（圖8）。

圖8 豨桐丸活性成分治療RA的MCODE聚類分析

2.3.6 GO富集分析將治療藥物與疾病的共有靶點進行GO富集分析，共富集到2 058條生物過程，119項分子功能相關，55項細胞組成相關。用R 3.6.3軟件進行柱狀圖繪制，選擇BP、MF、CC富集程度的前10條通路作圖，如圖9。

GO富集分析（圖9）表明豨桐丸在治療類風濕性關節炎的過程主要涉及脂多糖反應（response to lipopolysaccharide）、類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、細菌起源分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、對外部刺激的調節反應（regulation of response to external stimulus）、骨髓細胞分化（myeloid cell differentiation）、節律過程（rhythmic process）、炎癥反應的調節（regulation of inflammatory response）等生物過程。細胞組分主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微區（membrane mirodomain）、膜區（membrane region）、突觸前膜的組成部分（integral component of presynaptic membrane）、突觸前膜的固有成分（intrinsic component of presynaptic membrane）、突觸膜的組成部分（integral component of synaptic membrane）、突觸前膜（presynaptic membrane）等。此外，主要涉及的分子功能有核受體活性（nuclear receptor activity）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、類固醇結合（steroid binding）、絲氨酸肽酶活性（serinetype peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、絲氨酸型內肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、血紅素結合（heme binding）等。

圖9 豨桐丸活性成分治療RA的GO富集分析

2.3.7 KEGG通路富集將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，富集到共133條信號通路。運用R 3.6.3軟件進行氣泡圖繪制，見圖10。豨桐丸在治療RA的過程中可能是通過神經活性受體—配體相互作用（neuroactive ligand－receptor interaction）通路、癌癥蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、人巨細胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection）、糖尿病并發癥中的ACE－RAGE受體信號通路（ACE－RAGE signaling pathing in diabetic complications）、乙肝通路（hepatitis B）、皰疹病毒感染通路（kaposi sarcoma－assciated herpesvirus infection）等通路發揮作用。說明豨桐丸主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝通路中，多成分、多靶點的相互作用可能是豨桐丸發揮療效的作用機制。

圖10 豨桐丸活性成分治療RA的KEGG富集分析

3 討論

本研究運用分子對接和分子動力學的研究方法篩選出了豨桐丸治療RA的活性成分，結合網絡藥理學的方法驗證了篩選結果的準確性，并進一步闡明了豨桐丸治療RA的分子機制。兩者相輔相成，從多個方面證實豨桐丸是通過多成分、多靶點、多通路的協同作用來發揮療效的。

根據分子對接、分子動力學模擬及網絡藥理學的“藥物－成分－疾病－靶點”網絡的拓撲屬性分析結果，本研究從理論上解釋了以上活性成分的可能的抗RA機制。通過分子對接結果發現豨桐丸中對治療RA的相關酶有強抑制作用的活性物質有豆甾醇（7）、羽扇豆醇（11）、谷甾醇（19）及芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷丁酯（21）和一定抑制作用的有白樺脂酸（3）、木栓酮（10）、異類葉升麻苷（14）、臭梧桐素（17）等7種化學成分，提示上述成分可能是豨桐丸發揮藥效的主要藥效物質基礎，且主要是通過疏水作用抑制靶蛋白活性發揮治療作用。研究表明，豆甾醇（7）不僅能夠抑制JAK信號通路，還能明顯抑制MMP9的表達，抑制PTGS2的釋放，同時抑制軟骨的降解，證明了豆甾醇具有治療骨關節炎的潛力［34］。谷甾醇（19）的抗炎機制是通過抑制NO的合成，降低白細胞介素－6（inter leukin－6，IL－6）活性，減少NF－κB遷移和炎癥因子的分泌來實現的［35］，且具有調節骨代謝平衡的藥理活性［36］；羽扇豆醇（11）可抑制人VEGFA表達，防止血管再生［37］，能夠調節炎癥通路（MAPK通路）中多蛋白的表達實現抗炎［38］。芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖酸醛苷丁酯（21）具有保護神經組織和骨組織的功能，促進破骨細胞的凋亡和炎癥因子的分解［39］。網絡藥理學結果表明，豨桐丸發揮治療的作用是而一個復雜的生物學過程，通過PPI分析并構建相關網絡，篩選到ALB、TNF、VEGFA、MAKP3、SRC、PTGS2等20個核心靶點蛋白，這些蛋白共同參與調控RA的發展。其中，ALB作為炎癥反應的先導產物，可以激活p38MAPK蛋白通過乙肝通路產生炎癥反應［40］；TNF－α作為促炎因子，誘導滑膜成纖維樣細胞釋放VEGFA，使成纖維細胞與毛細血管內皮細胞過度增生，形成血管翳，造成骨關節的破壞［41］。此外，SRC，PTGS2的高表達也與RA密切相關［42－43］?；诖耍覀冋J為豨桐丸可能是通過影響ALB、TNF、VEGFA、MAPK3、SCR、PTGS2等蛋白的表達而發揮其治療RA的作用。其中，神經活性配體受體相互作用通路是富集得到的關鍵通路，它是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的配體的集合［44］。由此可見，豨桐丸對RA的治療作用可能是通過活性成分調控基因MAPK的表達，影響MAKP調節著多種基因的表達［45］，控制蛋白的分泌，最終匯集在神經活性配體受體相互作用通路等通路上起到治療的作用。

本研究能夠為豨桐丸的推廣使用及治療RA藥物的設計與研發提供理論指導，但更深入的作用機制研究仍需進一步的體外活性測試及動物實驗加以驗證。