血清miR-150表達水平與膿毒癥患兒疾病嚴重程度及預后的相關性分析*

趙曉敏，江曉宇，單凱莉，單鐵英，王洪新，張 倩，劉秀珍

河北省邯鄲市中心醫院兒科，河北邯鄲 056000

膿毒癥是由感染引起宿主反應失調的全身炎癥反應綜合征，失控時可進一步進展至膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，可影響患兒的臨床預后[1]。住院患兒由于機體臟器功能發育不全，抵抗感染和減輕炎性反應的能力下降，持續的全身炎性反應可加重患兒的原發疾病病情，容易進展至膿毒癥休克和多器官功能障礙，增加住院患兒病死率及延長住院時間，導致臨床預后不良[2]。目前膿毒癥的診斷主要依賴于生命體征的變化及血清炎癥因子和血氣分析檢查，通過以上方式早期評估膿毒癥患兒的疾病嚴重程度和炎性反應，可盡早避免疾病進展至多器官功能障礙，降低患兒病死率。微小RNA(miRNA) 是新近發現的一類在轉錄后水平上對基因的表達進行調控的非編碼RNA，參與炎癥、腎臟疾病、心血管疾病、腫瘤等多種疾病調節過程，因此近年來逐漸被認識并廣泛深入研究[3]。在膿毒癥患兒中，多種miRNA參與疾病的發生、發展及調控過程，例如miR-125b[4]、miR-146[5]、MIR223[6]等。然而，目前miR-150在膿毒癥患者尤其是患兒中的表達情況尚不明確，其與疾病的嚴重程度、炎性反應及死亡風險等關系值得更加深入地探討。因此，本研究擬探討血清miR-150在膿毒癥患兒的表達情況，分析血清miR-150表達水平與疾病嚴重程度、炎性反應及28 d病死率的關系，以期尋找評價膿毒癥患兒疾病病情和臨床預后的血清學指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年12月本院收治的膿毒癥患兒137例作為膿毒癥組。入選標準：(1)年齡3～<14歲，男女不限。(2)膿毒癥的診斷參照相關標準[7]，有明確證據表明患兒存在感染或高度懷疑感染并伴發以下征象。①呼吸頻率≥22次/min，意識改變，收縮壓≤100 mm Hg和(或)平均動脈壓<70 mm Hg；②動脈氧分壓<300 mm Hg和(或)氧體積分數<40 kPa；③膽紅素≥33 μmol/L；④尿量<500 mL/d。(3)研究對象監護人同意參與并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并惡性實體腫瘤或者血液系統腫瘤；(2)近3個月接受免疫抑制劑治療；(3)合并自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎；(4)交流溝通障礙或伴有精神疾病。膿毒癥組男性79例、女性58例，平均年齡為(11.52±1.91)歲。另選取同期本院收治的非膿毒癥住院患兒87例作為對照組，其中男性51例、女性36例，平均年齡為(11.43±1.15)歲。兩組年齡、性別比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲本院倫理委員會批準進行。

1.2血清miR-150檢測 兩組患兒清晨空腹狀態采集肘靜脈血共5 mL，以3 000 r/min轉速且離心直徑為80 cm的條件下，離心10 min，取上層血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用RNA提取純化試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)完成血清總RNA的提取，采用實時熒光定量PCR技術檢測入組患兒miR-150表達水平。以U6為內參對照，反應溫度94 ℃ 2 min進行1個循環，94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min內完成35個循環，最后72 ℃ 5 min完成1個循環，通過2-ΔΔCt法分析其相對表達水平。miR-150的上游引物為5′-GGA ACA GCA GGT CTG GT-3′,下游引物為5′-CCA CAG ACA TGG GCA GG-3′。U6上游引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.3資料收集與檢測方法 收集患兒的基線資料，包括年齡、性別、格拉斯哥昏迷(GCS)評分[8]、基線急性生理功能和慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHE Ⅱ)評分[9]、序貫器官衰竭評分(SOFA)評分[10]、基線血肌酐、基線預估的腎小球濾過率(eGFR)、血紅蛋白、血小板、乳酸、尿酸、降鈣素原、血清清蛋白、C反應蛋白，同時隨訪患兒從確診膿毒癥起始的28 d是否發生死亡。GCS評分由睜眼反應、語言反應和肢體運動 3部分組成，總得分為三者之和，總分為0～30分，分數越高則昏迷程度越嚴重。血常規使用廣州邁瑞公司BC5000全自動血細胞分析儀進行檢測，血清清蛋白、尿酸和血肌酐采用美國貝克曼公司型號為Beckmancoulter的LX20儀器檢測，乳酸采用德國Senslab公司型號為Lactata-scout的便攜式乳酸鹽分析儀檢測，降鈣素原采用德國Berthold公司生產的型號BLA250的檢測儀器檢測，C反應蛋白采用Rche公司出產的MODULARP型號 P800全自動生化分析儀檢測，eGFR按慢性腎臟病流行病協作研究(CKD-EPI)公式計算[11]。

2 結 果

2.1兩組患兒臨床基線資料比較 與對照組比較，膿毒癥組APACHE Ⅱ評分、GCS評分、SOFA評分及血肌酐、乳酸、降鈣素原、C反應蛋白水平較高，eGFR、血清清蛋白和血清miR-150表達水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組其余臨床指標包括年齡、性別、血紅蛋白、血小板計數、尿酸水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患兒臨床基線資料比較

2.2膿毒癥患兒miR-150表達水平與疾病嚴重程度、炎性反應相關性分析 根據膿毒癥患兒miR-150表達水平的平均值作為界限，分為低miR-150組(miR-150<0.20)64例和高miR-150組(miR-150≥0.20)73例，比較兩組患兒疾病嚴重程度指標(APACHE Ⅱ評分、GCS評分、SOFA評分)和炎性指標(降鈣素原和C反應蛋白)水平差異。低水平miR-150組的APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、降鈣素原和C反應蛋白水平均高于高水平miR-150組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而兩組GCS評分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。采用Pearson相關性分析膿毒癥患兒血清miR-150表達水平與APACHE Ⅱ評分、GCS評分、SOFA評分、降鈣素原和C反應蛋白之間的相關性，結果顯示miR-150表達水平與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、降鈣素原和C反應蛋白呈負相關(P<0.05)。見表3。

表2 低miR-150組和高miR-150組各指標水平比較

表3 miR-150與疾病嚴重程度、炎性反應的相關性分析

2.3膿毒癥患兒28 d死亡危險因素分析 建立Logistic回歸模型，以137例膿毒癥患兒的基線資料為樣本，以發生膿毒癥后28 d是否死亡作為因變量，連續變量按照兩組總均值進行分段，轉化為兩分類變量，以提高統計效率使回歸結果清晰。137例膿毒癥患兒中死亡51例(死亡組),存活86例(生存組)。其中與生存組相比，死亡組APACHE Ⅱ評分、SOFA評分及血肌酐、降鈣素原、C反應蛋白、乳酸水平較高，eGFR、血清清蛋白和血清miR-150表達水平較低(P<0.05)。選取單因素Logistic回歸分析中具有統計學意義的變量納入多因素Logistic回歸分析，回歸過程采用“進入法”以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05，連續變量按照兩組總均值進行分段，回歸結果：共有APACHE Ⅱ評分、乳酸、血肌酐、血清清蛋白、降鈣素原、C反應蛋白和血清miR-150被保留入回歸方程。APACHE Ⅱ評分升高，高水平的乳酸、血肌酐、降鈣素原、C反應蛋白，以及低水平血清清蛋白和血清miR-150均是膿毒癥患兒28 d死亡的危險因素(OR>1，P<0.05)。見表4、5。

表4 膿毒癥患兒死亡組和生存組臨床資料比較

表5 膿毒癥患兒28 d死亡的多因素logistic回歸分析

3 討 論

膿毒癥是指由感染因素引起的全身炎癥反應綜合征，嚴重者可導致全身多器官功能障礙，是嚴重創傷、燒傷、休克、感染和外科大手術等常見的并發癥。膿毒癥和膿毒癥休克是住院患兒死亡的主要原因，全世界范圍內數百萬人死于膿毒癥，病死率高達25%[12]。膿毒癥涉及全身炎性反應、免疫功能缺陷、基因遺傳易感性等多種不同機制，且膿毒癥患兒的病理生理與成人存在較大差異，其診斷、治療和病情評估具有其特殊性[13]，準確評估膿毒癥患兒的疾病嚴重程度和炎性反應能盡早預判患兒的臨床預后，采取積極的治療措施可改善膿毒癥患兒的臨床結局。

miRNA是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，在細胞內具有多種重要的調節作用。miRNA在膿毒癥患兒的炎性反應和免疫調控方面發揮著重要作用[14-15]。細胞膜表面識別細菌組分的固有免疫相關的模式識別受體——Toll樣受體，誘導產生miRNA，進而介導炎癥介質的釋放和信號傳導。miR-150是一個由大約22nt組成的單鏈非編碼小分子RNA，具有組織表達的特異性，參與免疫調節過程。既往在健康者和膿毒癥患兒的全基因組miRNA芯片分析提示，miR-150在膿毒癥患兒中具有較高的差異性表達[16]。此外，miR-150與炎性反應中的炎癥介質如白細胞介素-18(IL-18)、白細胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的編碼基因序列具有一定的互補關系，因此可能參與膿毒癥炎癥因子和炎性反應的調控[17]。本研究結果發現，膿毒癥組miRNA-150表達水平明顯低于對照組，且miR-150低水平組的APACHE Ⅱ評分和SOFA評分高于miR-150高水平組，降鈣素原和C反應蛋白的水平也高于miR-150高水平組。既往相關研究也表明，膿毒癥患兒血漿中miR-150的表達較正常組減少，且其表達水平與SOFA評分相關，可用于評價膿毒癥患兒的疾病嚴重程度[16]。在心血管疾病領域也表明，急性心力衰竭患兒miR-150表達水平明顯低于健康人群[18]。miR-150對于疾病的調節，主要是通過特異性結合靶位基因，負性調控目的基因的表達，進而導致疾病進程發生變化。

此外，本研究還發現，miR-150表達水平與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、降鈣素原和C反應蛋白水平呈負相關。miR-150表達水平越低，疾病的嚴重程度越高，炎性反應越嚴重。miR-150對膿毒癥患兒炎性反應的調控，主要基于miR-150能夠在轉錄后水平調節基因的表達，調節Toll樣受體信號通路的起始、終止和反應強度，而Toll樣受體作為模式識別受體，能夠通過多種途徑激活相關信號激酶，引起炎癥介質的表達和釋放，參與炎性反應和免疫調節過程[17]。此外，miR-150與IL-18、IL-10和TNF-α的編碼基因序列具有一定的互補關系，能夠負性調控膿毒癥患兒IL-18、IL-10和TNF-α水平[18]。IL-18、IL-10和TNF-α作為膿毒癥患兒中參與炎性反應重要的炎癥介質，直接反映膿毒癥患兒的炎癥水平[17]。

本研究還發現，APACHE Ⅱ評分升高，高水平的乳酸、血肌酐、降鈣素原、C反應蛋白，以及低水平血清清蛋白和血清miR-150均是膿毒癥患兒28 d死亡的危險因素。APACHE Ⅱ評分作為危重癥醫學重要的評分系統，能夠反映疾病的嚴重程度，預測患兒的死亡風險。高水平的乳酸同樣可以用于預測膿毒癥患兒的死亡[19]。血肌酐水平升高則反映機體排泄代謝產物的能力下降，進而影響患兒的臨床預后。低血清清蛋白患兒合成免疫球蛋白的能力下降，降低機體的免疫能力，從而增加膿毒癥患兒的死亡風險。炎癥水平較高的患者由于感染容易累及多臟器功能衰竭，增加臨床死亡風險。miR-150表達水平不但反映機體炎性反應狀態，而且在一定程度上能作為判斷疾病嚴重程度及預后的指標。miR-150表達水平越低，提示膿毒癥患兒的疾病嚴重程度越高，相應的死亡風險也越高。

本研究發現血清miR-150表達水平能夠評估膿毒癥患兒的疾病嚴重程度和炎性反應，對于預測28 d病死率具有一定的臨床應用價值。但本研究為單中心小樣本研究，需要進一步擴大樣本量提高研究的循證證據力度；此外，本研究未能動態監測血清miR-150表達水平變化，其表達水平是否能夠評估疾病轉歸過程仍然需要更多的研究證據。

綜上所述，膿毒癥患兒血清miR-150表達水平低下，且能夠反映疾病的嚴重程度和炎癥水平，預測患兒的死亡風險，可以作為協助評估膿毒癥患兒病情的血清學指標。