慢性心力衰竭患者外周血單個核細胞miR-590表達與左心室重構和炎性反應的關系*

朱洪新，王 濤，王 皓，霍建鳳

秦皇島市第二醫院：1.心內科；2.呼吸科,河北秦皇島 066600

左心室功能障礙和左室射血分數(LVEF)降低患者心力衰竭進展過程中通常伴隨著進行性的左心室擴張和左心室重構[1]。慢性心力衰竭(CHF)可能發生在心肌梗死、血流動力學超負荷或原發性心肌疾病患者中。盡管這些疾病的病因不同，但它們有著共同的病變途徑，最終導致病理性左心室肥厚和左心室重構的發生。左心室重構是由多種生長因子和細胞因子之間復雜的相互作用所介導的，例如神經體液因子、細胞炎癥因子、氧化應激、機械應力等[2]。此外，各種應激誘導的microRNAs(miRNAs)也是心力衰竭發生機制的關鍵調節因子，并有望成為新的治療靶點。應激誘導的miR-590被認為是病理性心肌肥大和心肌纖維化的有效調節因子，其作用與靶向作用于炎癥信號通路有關。基于一些基礎研究和動物實驗[3-4]，推斷外周血單個核細胞(PBMC)中miR-590表達與CHF患者的左心室重構和功能障礙有關。在本研究中連續采集了134例CHF患者的血液樣本以探討PBMC中miR-590相對表達水平與超聲心動圖表現、炎性反應之間的關系，并試圖找出預防和治療CHF進展的新靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月在本院就診的CHF患者134例作為研究組，其中男性78例、女性56例，年齡為39～87歲、平均(65.96±11.91)歲。CHF診斷基于病史、體格檢查、心電圖、胸部放射學、超聲心動圖和冠狀動脈造影，符合CHF的診斷標準[5]。納入標準：(1)紐約心臟病協會(NYHA)心功能分級Ⅱ～Ⅳ級[6]；(2)LVEF≤50%，心力衰竭持續≥4周；(3)有心肌梗死病史、高血壓(原發性高血壓診斷)和特發性擴張型心肌病病因。這些CHF患者服用標準藥物治療方案，包括利尿劑、正性肌力藥(如地高辛)、他汀類、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和(或)血管緊張素1型受體阻滯劑(ARB)。排除標準：(1)維持性血液透析的終末期腎病、先天性心臟病、心包炎、原發性瓣膜病、肥厚性心肌病、急性心肌炎或任何已知系統疾病引起的繼發性心肌病者；(2)合并感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者。另選取同期本院的69例健康志愿者作為對照組，其中男性40例、女性29例，年齡為36～89歲、平均(66.72±13.85)歲，無急性或慢性疾病或心血管系統相關癥狀。對照組和研究組受試者年齡和性別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本院醫學倫理委員會批準了包括血樣分析在內的研究方案，并獲得所有患者的書面知情同意書。

1.2超聲心動圖檢查 所有患者完成基礎檢查、平板運動試驗，并使用Acuson Sequoia C256和Acuson Sequoia512超聲儀(探頭頻率為2.0～3.5 MHz)在左側仰臥位進行了二維超聲心動圖和多普勒檢查。通過優化增益設置、扇形角度和深度，獲得標準胸骨旁長軸視圖及3個標準的心尖四腔、二腔和長軸視圖。左室舒張末期容積(EDV)和左室收縮末期容積(ESV)按雙平面Simpson法計算。測量平均室壁應力(MWS)。根據美國超聲心動圖學會和歐洲心血管成像協會的建議，采用M-mode法測定左室質量指數(LVMI)。EDV為96～157 mL(男性)和59～138 mL(女性)，ESV為33～68 mL(男性)和18～65 mL(女性)被視為正常值。LVMI為>125 g/m2(男性)和>120 g/m2(女性)視為左心室肥厚。隨訪至2020年8月，通過超聲心動圖測定這些值。超聲心動圖圖像由兩名獨立的心臟病專家分析且不知道患者的身份。

1.3PBMC提取和miR-590相對表達水平檢測 采集所有研究對象外周靜脈血5 mL，采用Ficoll密度梯度離心法提取PBMC。利用mirVana PARIS提取試劑盒提取PBMC的總miRNAs，保存在-80 ℃下。加入等體積變性液后，加入50 pmol/L的秀麗隱桿線蟲miR-39(cel-miR-39)作為對照。采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒和特異性引物在ABI-7900實時PCR檢測系統中進行實時熒光定量PCR，擴增程序包括95 ℃預變性5 min，隨后95 ℃變性30 s+60 ℃30 s+72 ℃30 s共循環40個周期，收集熔解曲線。當熔化過程中的熒光信號為單重態時，結果是可靠的。采用2-ΔΔCt公式對其相對表達水平進行分析，用參考基因U6 mRNA校準各樣本miR-590相對表達水平。miR-590引物序列：正向5′-TAG CCA GTC AGA AAT GAG CTT-3′，反向5′-TGC TGC ATG TTT CAA TCA GAG A-3′。

1.4血清炎癥因子水平檢測 取血清,采用全自動生化免疫分析儀(ChemWell2910型)及其配套試劑盒進行檢測，采用雙抗體夾心法原理測定血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。另外取另一支含有2 mL血樣的試管，加入40 μL抑肽酶及30 μL 10%乙二胺四乙酸二鈉充分混勻，利用Beckman Array360 System及配套的診斷試劑盒，采用免疫散射比濁法測定血清超敏C反應蛋白(hs-CRP)。

2 結 果

2.1兩組PBMC中miR-590相對表達水平比較 研究組患者PBMC中miR-590相對表達水平為0.80±0.28，低于對照組(1.00±0.11)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2不同心功能級別的研究組各指標水平比較 研究組NYHA心功能分級Ⅳ級患者PBMC中miR-590相對表達水平低于Ⅱ～Ⅲ級患者，其血清IL-6、TNF-α、hs-CRP水平及EDV、ESV、LVMI、MWS高于Ⅱ～Ⅲ級患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同心功能級別的研究組各指標水平比較或M(P25,P75)]

NYHA分級n左心室重構EDV(mL)ESV(mL)LVMI(g/m2)MWS(kPa)Ⅱ級38138.53±25.9847.03±25.98110.59±12.5929.66±5.40Ⅲ級54134.74±44.7760.93±24.83a116.31±15.4333.42±5.25aⅣ級42156.21±42.70ab89.74±33.07ab130.54±17.58ab40.01±4.40abF/Z3.73524.75018.23043.770P0.026<0.001<0.001<0.001

2.3CHF患者PBMC中miR-590相對表達水平與血清炎癥因子、左心室重構指標的關系 Pearson相關分析顯示，研究組患者PBMC中miR-590相對表達水平與血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、EDV、ESV、LVMI、MWS呈負相關(r=-0.610、-0.451、-0.568、-0.455、-0.631、-0.432、-0.727，P<0.05)。

2.4多元線性回歸分析 以EDV為因變量，校正年齡、性別構成、病因、體質量指數、吸煙史、糖尿病史、IL-6、TNF-α、hs-CRP(包含ESV、LVMI、MWS)等因素，進行多元線性回歸分析，結果顯示PBMC中miR-590相對表達水平與EDV呈負相關(P<0.05)；同樣以ESD為因變量，校正上述混雜因素(包含EDV、LVMI、MWS)，多元線性回歸分析結果顯示PBMC中miR-590相對表達水平與ESV呈負相關(P<0.05)；以LVMI為因變量，校正上述混雜因素(包含ESD、EDV、MWS)，多元線性回歸分析結果顯示PBMC中miR-590相對表達水平與LVMI呈負相關(P<0.05)；以MWS為因變量，校正上述混雜因素(包含ESD、EDV、LVMI)，多元線性回歸分析結果顯示PBMC中miR-590相對表達水平與MWS呈負相關(P<0.05)。見表2。

表2 多元線性回歸分析PBMC中miR-590和左心室重構指標的關系

3 討 論

CHF是一種全球性的心臟疾病，疾病進展與左心室重構有關，表現為EDV、ESV逐漸增加，室壁變薄，LVEF持續下降，炎癥細胞因子在這個過程中發揮著重要作用。目前標準治療方法包括ACEI、ARB、β受體阻滯劑等對于延緩CHF進展有益，但是其預后仍不甚理想，致殘率和病死率較高，患者生活質量嚴重下降。因此，深入闡述CHF的發病機制對于探索和開發替代治療策略，具有重要的臨床意義。本研究結果顯示研究組PBMC中miR-590相對表達水平較對照組降低，而且隨著NYHA心功能分級的升高PBMC中miR-590相對表達水平進一步下調，說明miR-590在CHF疾病進展過程中屬于功能性因子，對于心功能降低有一定的保護作用；此外，CHF患者PBMC中miR-590相對表達水平與血清炎癥因子、左心室重構指標呈獨立負相關，這也進一步為支持miR-590可能參與CHF患者的心臟重構和功能障礙提供了可靠的證據。

CHF發生和發展的炎癥機制早已被眾多基礎和臨床研究所證實，無論是通過細胞因子激增、抗體生成還是細胞反應，促炎因子(如TNF-α、IL-6、hs-CRP)都是疾病進展的媒介[7-8]。促炎細胞因子通過介導內皮功能障礙、氧化應激、誘導貧血、誘導心肌細胞凋亡和肥大，引發一系列有害事件，最終導致心肌細胞收縮功能障礙[7-10]。ESKANDARI等[11]證實，CHF患者外周血PBMC中TNF-α和IL-6 mRNA表達及循環血清中的相應表達水平顯著增加，并且與CHF疾病嚴重程度呈正相關，說明慢性心臟病患者外周血中促炎因子TNF-α和IL-6的表達是反映病情嚴重程度和預后的重要指標。本研究CHF患者PBMC中miR-590相對表達水平與炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP均呈負相關，說明miR-590可能是通過參與炎性反應進而影響左心室重構進程。

EULALIO等[12]以高通量篩選方法培養了新生大鼠心室肌細胞，發現204個miRNAs顯著增加了乳鼠心肌細胞的增殖，尤其是miR-590可顯著促進出生7 d后乳鼠心肌細胞的增殖活性，而且進一步通過細胞實驗證實，上調miR-590可激活細胞周期和促進心肌細胞增殖。此外BRAGA等[13]證實在心肌梗死期間，miR-590不僅能刺激心臟再生，還能保護心臟功能，減少心臟纖維化。miR-590基因位于染色體7q11.23，成熟miR-590是在細胞核內進行編碼并在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初級miR-590(pri-miR-590)，然后經剪切形成發夾狀結構的前體miR-590(pre-miR-590)。pre-miR-590又進一步被Dicer剪切生成雙鏈RNA，即miR-590/miR-590*。miR-590通常是指miR-590-5p，屬于靠近5′端莖部的miRNA；miR-590*是指靠近3′端莖部的miR-590-3p，miR-590-3p通常很不穩定，經Dicer加工成熟后很快降解。因此更具備臨床研究價值的是miR-590。EKHTERAEI-TOUSI等[14]報道miR-590的主要作用靶點為轉化生長因子β受體(TGF-βR)，miR-590可直接作用于TGF-βRⅡ的3′UTR，下調TGF-βRⅡ水平，進而抑制Ang Ⅱ誘導的膠原蛋白分泌及肌成纖維細胞轉化，從而發揮抗纖維化效應。SINGH等[15]也認為上調miR-590-3p表達抑制大鼠或豬心臟成纖維細胞中特異性蛋白1的表達，上調心肌肌鈣蛋白T的表達水平，并推測這可作為增強人類心臟細胞重編程的替代途徑。此外,何平平[16]通過動物實驗也證實，miR-590可抑制Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化病變的發生、斑塊內的脂質蓄積、血漿脂質水平和炎癥因子的表達等。這些研究將為miR-590作為心肌梗死后恢復心功能的治療靶點的潛在作用提供有用的生物學信息。

本研究通過校正各種臨床混雜因素及炎癥因子因素，經多元線性回歸分析證實，CHF患者PBMC中miR-590相對表達水平與EDV、ESV、LVMI、MWS等左心室重構指標都呈獨立負相關，說明miR-590對于左心室重構過程有一定的影響，檢測PBMC中miR-590相對表達水平在一定程度上可反映心力衰竭進展。左心室重構通常是一個漸進的過程，開始于心肌損傷或過度的左心室負荷，其特點是心室容積緩慢遞增，左心室質量增加，壁厚適度增加，這主要是由于心肌損傷早期心肌細胞過度生長所致[17]。在某種程度上，最初的心肌重構可能被認為是有益的，因為通過增大心室腔的空間進而保留一定的射血分數，但是，當左心室擴張到一定程度時，這種適應機制可能會朝著不適應的重塑和左心室病理性肥厚發展。在這一階段中，增加的負荷由增加LVMI和MWS來補償，最終導致整個心室收縮能力的進行性下降[18]。因此，EDV、ESV、LVMI、MWS對于左心室重構過程都有一定的相關性。而miR-590與這些參數都有一定的獨立相關性，說明檢測PBMC中miR-590相對表達水平在一定程度上可以預測不良左心室重構的后續發展。

綜上所述，對于CHF患者，miR-590表達與左心室重構指標(EDV、ESV、LVMI、MWS)均呈獨立負相關，PBMC中miR-590相對表達水平降低在一定程度上反映了不良左心室重構，這可能與miR-590參與炎性反應調節有關。本研究結論為深入闡述CHF進展機制及尋找臨床治療靶點提供了新的思路。