核酸適配體在敗血癥實驗診斷中的初步應用*

王志瑛，向 韡，李衛濱,3△

1.聯勤保障部隊第九〇〇醫院檢驗科，福建福州 350025；2.廈門大學公共衛生學院，福建廈門 361100; 3.福建醫科大學醫學技術與工程學院，福建福州 350025

敗血癥是由于各種細菌感染引起的全身炎癥反應綜合征，是臨床上常見的重癥感染，也是全球性的公共衛生問題。在世界范圍內，每年有超過1 800萬人感染敗血癥，其病死率高達40%[1]。敗血癥病原體的快速檢測，對提高患者的生存率至關重要。目前，敗血癥實驗診斷的方法主要是檢測C-反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、血細菌培養，存在特異度不理想和檢測時間長等局限性。相比之下，近來出現的基于聚合酶鏈反應(PCR)能夠將診斷時間縮短至數小時，但是難以在基層醫院開展。核酸適配體是通過指數富集的配基系統進化(SELEX) 技術產生的核酸分子探針，相比于傳統的檢測抗體，適配體的生產成本低，化學性質穩定，不存在批間差。檢測靶標涵蓋小的有機分子到復雜的蛋白質或全細胞，幾乎能與自然界中所有的分子相互作用[2]。肽聚糖為革蘭陽性和革蘭陰性細菌共有的細胞壁聚合物[3]，占革蘭陽性菌細胞壁干重的50%～80%，革蘭陰性菌的細胞壁干重的5%～20%，Antibac1 和Antibac2 為肽聚糖核酸適配體序列[4-5]，本研究旨在以Antibac1 和Antibac2為分子探針初步建立基于適配體的qPCR新方法用于細菌檢測。

1 材料與方法

1.1材料 細菌菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，金黃色葡萄球菌ATCC 29213，銅綠假單胞菌ATCC 27853，白色念珠菌，以上均為聯勤保障部隊第九〇〇醫院檢驗科微生物室保存菌株。

1.2儀器與試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)由本實驗室配制(137 mmol/L NaCl2,2.7 mmol/L KCl,4.3 mmol/L Na2HPO4·7H2O,1.5 mmol/L KH2PO4)；細菌培養平板為哥倫比亞血瓊脂培養基，購自梅里埃生物制品有限公司；細菌培養溫箱為35 ℃二氧化碳培養箱，購自美國SHELLAB-2306；比濁瓶為無菌生理鹽水緩沖液，購自梅里埃生物制品有限公司；DENSIMAT細菌比濁儀，購自梅里埃生物制品有限公司；PCR儀為Bio-Rad的CFX-96 Real-Time System，C1000 Thermal Cycler，操作系統為Bio-Rad CFX Manager，購自美國伯樂公司；熒光染料SYBR Green Ⅰ、PCR Taq Mix、qPCR Mix購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3適配體與隨機序列庫 適配體Antibac1：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GAC AGG GAG TGC GCT GCT CCC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；適配體Antibac2：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GGA CTA GAG GAC TTG TGC GGC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；隨機核酸序列文庫：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GTT CCA ACA TAG TGT CTG ATT TTC TTA ATG GTA GGC GAG CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；隨機核酸序列正向引物：5′-TCG CGC GAG TCG TCT G-3′；隨機核酸序列反向引物：5′-GGG AGG ACG ATG CGG-3′。隨機序列的正反向引物與Antibac1和Antibac2的3′端和5′端有相同結合位點[5]。以上適配體、隨機序列核酸文庫與引物均由上海生工生物技術公司合成。

1.4方法

1.4.1菌株培養與調配 實驗菌株在35 ℃二氧化碳溫箱中培養24 h，挑取3～4個單菌落加入去熱源EP管中，振蕩混勻，室溫用PBS 8 000×g離心10 min洗滌3次，棄上清液，用適量PBS將沉淀吹打混勻，加入測定濁度專用玻璃瓶中，在吸光度600 nm波長下將吸光度值調整為0.5個麥氏比濁單位。操作方法參考文獻[6]并根據實驗室的條件進行了優化。

1.4.2適配體-細菌結合反應 將50 μL調制好的菌懸液加入經牛血清清蛋白(去除非特異結合)包被過夜的EP管中，再加入50 μL的適配體序列Antibac1及Antibac2(0.1 μmol/L)在室溫下震蕩孵育結合45 min。在上述適配子-細菌結合物中加入1 mL PBS，顛倒混勻3次，8 000×g離心6 min洗滌結合物3次，最后一次洗滌將上清全部棄去。在EP管中加入25 μL無菌水重懸適配體，將EP管置于95 ℃水浴鍋中洗脫適配體5 min，8 000×g，4 ℃條件下離心5 min，吸取1 μL上清(含洗脫適配體)加入20 μL PCR體系進行qPCR定量測定。

1.4.3實時qPCR分析 PCR體系：10 μL Mix，3 μL上游引物(10 μmol/L)，3 μL下游引物(10 μmol/L)，3 μL無菌水，1 μL模板(0.1 μmol/L)。 qPCR條件：95 ℃預變性1 min，40個循環的95 ℃變性45 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，平行實驗3次，以隨機序列庫作為對照。

1.4.4親和力標準曲線測定 配制PCR反應混合體系,先在各管加入17 μL混合體系，再在1～6各管依次加入3 μL梯度濃度的模板，第7管加入3 μL無菌水，各管濃度依次設為10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1 μmol/L。

1.5統計學處理 根據不同濃度適配體qPCR測定結果進行 Linewaver-Burk的非線性回歸分析，使用公式1/[complex] = kd/[Cmax] × 1/[aptamer] + 1/[Cmax]進行計算解離常數(kd)值。其中kd值是穩定狀態下適配體的解離常數；[complex]是細菌-適配體復合物的濃度；[Cmax]是在適配體的最大結合效率下，也就是細菌的所有位點都被適配體占據的情況下復合物的濃度；[aptamer]是實驗中適配體的濃度[5]。

2 結 果

2.1適配體Antibac1的特異度 qPCR-CQ值顯示，0.1 μmol/L適配體Antibac1能夠識別大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，與白色念珠菌結合CQ值很低，說明特異度較好,見圖1。

圖1 適配體 Antibac1結合特異度實驗

2.2適配體Antibac1的靈敏度 將不同濃度適配體Antibac1分別與0.5個麥氏單位的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌液結合，測定CQ值，說明10-6μmol/L適配子可以檢測到1.5×108細菌數,見圖2。

圖2 適配子Antibac1結合靈敏度實驗

2.3適配體Antibac1親和力標準曲線 為了進一步分析適配子的結合效率，采用實時qPCR的方法測定了適配體Antibac1和Antibac2對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的結合力。DNA稀釋度-ΔCQ值的圖表(圖3)顯示適配子Antibac1對不同細菌的擴增效率大致相同，相對于隨機序列文庫，適配體Antibac1能夠以更高的結合效率與臨床常見的致病性金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌相結合。

注：SA表示金黃色葡萄球菌；e.coli表示大腸埃希菌；p表示銅綠假單胞菌。

2.4適配體Antibac1解離常數kd值的測定 適配體Antibac1對于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的kd值分別為33.3、102.7、373.7 μmol/L。而Antibac2對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的結合不理想，kd值無法計算。適配體Antibac1與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的結合親和力見圖4，kd值越小，親和力越高，說明Antibac1與大腸埃希菌結合親和力最強。

圖4 Antibac1結合親和力kd值計算

3 討 論

本研究目標聚焦細菌細胞壁肽聚糖的適配體Antibac1和Antibac2對細菌的檢測，采用qPCR方法分析Antibac1和Antibac2與3種敗血癥主要細菌的特異度與靈敏度及結合親和力。本研究結果表明，Antibac1對不同的細菌結合效率都較高，不僅能結合革蘭陽性菌種(金黃色葡萄球菌)，還結合革蘭陰性細菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌)，說明Antibac1能夠識別這3種細菌細胞壁中的靶分子，Antibac1的結合親和力甚至有可能反映出這些細菌的細胞壁上肽聚糖的差異[4]。理論上Antibac1與金黃色葡萄球菌結合親和力應該強于大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，但結果其與大腸埃希菌結合親和力最強，下一步將增加細菌種類進一步驗證[5]。目前，基于核酸適配體的生物傳感器已經開始應用于細菌性疾病的檢測[7]。這些細菌易引發菌血癥、敗血癥，甚至膿毒血癥，是重要的醫院獲得感染病原菌，是重癥監護病房感染的常見病原體[8]。

適配體Antibac1和Antibac2檢測結果的差異，可能是因為兩個適配體的qPCR擴增、洗脫條件不同，需要進一步優化Antibac2與細菌結合條件以及PCR擴增條件。下一步將合成熒光標記的適配體序列，在熒光顯微鏡下確認適配體與菌體的結合，佐證適配體結合的特異度。另外，qPCR擴增時增加 “內參序列”，并加入其對應的引物序列一起擴增以監測擴增體系的穩定性，確保整個擴增過程的標準化。

近年來在診斷領域，核酸適配體廣泛應用于特異性地識別和結合多種類型的靶標，包括活細胞或細菌。適配體作為小分子，化學性質穩定、生產成本低、生產不存在批間差，另外，其對pH值和溫度等環境變化具有很強的適應性，并且在結構設計中具有顯著的靈活性。因此，基于適配體的生物傳感器能夠克服傳統的抗體生物傳感器的一些缺點，目前已經開發了多種用于微生物病原體檢測的適配體傳感器[9]。

總之，本研究證實，靶向細菌肽聚糖的ssDNA適配體能夠識別敗血癥幾種相關的革蘭陽性與陰性細菌，Antibac1可用于開發生物傳感器探針，在臨床中快速檢測細菌，亦可聯合使用不同的核酸適配體，提高對于不同類型細菌的檢測效率，加速診斷和治療，提高敗血癥患者的生存率。