乙型肝炎病毒感染母嬰阻斷療效的影響因素及其與TNF-α-308基因多態性的關系

趙 姝，張 英，陳 晶，趙曉娟

(青島市中心醫院產科，山東 青島 266042)

孕產婦母嬰傳播是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的重要傳播途徑，通過母嬰傳播的HBV感染者占HBV感染人群的30%以上[1]。感染HBV的新生兒超過90%會逐漸發展為HBV感染患者[2]，故孕期母嬰阻斷治療對預防新生兒感染HBV有重要意義。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是人體炎癥反應、免疫應答體系的重要參與因子，其基因多態性與HBV感染的發生密切相關[3]。研究表明機體TNF-α-308 G/A基因多態性影響體內TNF-α的轉錄、表達，當TNF-α-308位點為G變為A等位基因時，機體內TNF-α-308位點周圍轉錄因子無法識別激活蛋白-2，影響TNF-α的表達[4]。目前，關于TNF-α-308基因多態性與HBV感染孕產婦母嬰阻斷治療效果的研究報道較少，本研究選取104例HBV感染的孕產婦為研究對象，分析HBV感染母嬰阻斷療效的影響因素及其與TNF-α-308基因多態性的關系，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年7月至2019年12月青島市中心醫院收治的104例HBV感染母嬰阻斷治療孕產婦為研究對象，根據治療效果分為阻斷失敗組(21例)、阻斷成功組(83例)，所有研究對象均符合以下納入及排除標準。本研究經過醫院倫理委員會審批通過。

納入標準：①符合2019年版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]中關于HBV診斷標準；②年齡大于20歲；③HBV DNA病毒載量大于2×105IU/mL且同意接受抗病毒藥物干預；④自然妊娠、單胎、足月分娩；⑤自愿簽署本研究知情同意書。排除標準：①重要臟器功能障礙者；②伴有急性感染、嚴重內外科疾病者；③伴有惡性腫瘤、酒精等造成的肝臟損傷者；④伴有免疫功能缺陷者；⑤存在認知或溝通障礙者；⑥近1個月內接受過抗病毒治療者；⑦伴有甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者；⑧入組患者之間具有親緣關系者。

1.2 方法

1.2.1 母嬰阻斷治療

所有研究對象參照《感染乙型肝炎病毒的育齡女性臨床管理共識》[6]對所有HBV感染孕產婦自妊娠24～28周開始服用富馬酸替諾福韋二吡呋酯或替比夫定抗病毒治療。

1.2.2 TNF-α-308基因多態性檢測

所有孕產婦分娩前均抽取靜脈血液3mL，乙二酸四乙酸二鉀抗凝用DNA純化試劑盒提取，嚴格按照試劑盒使用說明操作。查詢美國國立生物技術信息中心官網獲取人類TNF-α基因序列，設計擴增TNF-α-308 G/A位點基因在熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀上擴增。PCR擴增方法：反應體系25μL：上下游引物各1μL、cDNA模板1μL，95℃預變性2min，95℃變性1min，62℃退火1min，75℃延伸1min，循環35次，最后一次75℃延伸5min，5℃終止反應，最后分離PCR擴增產物并進行TNF-α-308 G/A位點的等位基因及基因型鑒定。TNF-α上游引物為5′-AGGCCTAATCAGGTTTTCCAT-3′，下游引物為5′-TCCTGCTGCACTCCATTCG-3′。

1.2.3 血漿HBV病毒載量檢測

所有孕產婦分娩前抽取空腹靜脈血5mL，肝素抗凝，抗凝全血6h內進行離心處理(3 000r/min離心10min，離心半徑12cm)，收集血漿，采用核酸提取儀(法國梅里埃Easy-MEG型)、病毒載量檢測儀(瑞士羅氏TaqMan96型)、HBV病毒載量檢測試劑盒(法國梅里埃公司)、PCR儀(瑞士羅氏LightCycler 96型)進行實時熒光定量測定HBV DNA病毒載量，試驗嚴格參照說明書標準操作。

1.3 觀察指標

①母嬰阻斷療效。嬰兒完成主被動免疫(嬰兒出生6h內、出生15d分別注射200IU乙型肝炎免疫球蛋白，出生24h內、出生后1個月、出生后6個月分組注射重組酵母乙肝疫苗10μg)，之后于7月齡時采集外周血，HBsAg陽性、HBV DNA陽性(伴或不伴HBeAg陽性)則記為阻斷失敗，否則記為阻斷成功[7]。②比較阻斷成功組和阻斷失敗組臨床資料，包括年齡、孕前體質量指數(body mass index，BMI)、產次、抗病毒治療藥物類型、分娩方式、HBV感染病程、產后是否停藥、母乳喂養情況，產后谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平、C反應蛋白(C-reaction protein，CRP)含量、外周血白細胞計數、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-4、IL-18，分娩前HBV基因型、乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)、血漿HBV病毒載量、TNF-α-308基因多態性及新生兒合并口腔潰瘍情況等。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

阻斷失敗組孕前BMI、ALT、C反應蛋白、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒載量均顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，而IL-18顯著低于阻斷成功組(P<0.01)。兩組患者其余臨床資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of the patients between the two groups

2.2 TNF-α-308 G/A位點基因型頻率、等位基因頻率與HBV感染母嬰阻斷失敗的關系

TNF-α-308 G/A位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05)，具有群體代表性。阻斷失敗組TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率表達顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，見表2。

表2 TNF-α-308 G/A位點基因型頻率、等位基因頻率與HBV感染母嬰阻斷失敗的關系[n(%)]Table 2 Relationships of genotype frequency and allele frequency of TNF-α-308 G/A locus with failed mother-to-child transmission blocking of HBV infection[n(%)]

2.3 影響HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的多因素分析

以HBV感染孕產婦母嬰阻斷是否失敗為因變量(成功=0，失敗=1)，孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBVDNA病毒載量、IL-18、TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率為自變量，并將上述自變量賦值為連續變量進行Logistic回歸分析，多因素分析顯示HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率是HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的多因素分析Table 3 Multiple factor analysis of failed mother-to-infant trasmission blocking of HBV infection

3 討論

HBV母嬰垂直傳播是家族聚集性HBV感染的重要原因，感染者發生肝硬化、肝癌的風險明顯增加，且發病年齡逐代提前[8]。我國HBV攜帶者約40%為女性，部分地區孕產婦HBsAg陽性率可高達10%左右[9]。因此，盡早對HBV感染孕產婦母嬰阻斷情況進行判斷，及時開展診療措施對改善預后意義重大。

3.1 HBV感染孕產婦母嬰阻斷療效的影響因素

本研究結果發現阻斷失敗組孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒載量均顯著高于阻斷成功組(P<0.05)，而IL-18顯著低于阻斷成功組(P<0.01)，且阻斷失敗組TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率表達顯著高于阻斷成功組(P<0.05)。多因素分析結果顯示HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率是HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的危險因素(P<0.05)，提示HBV DNA病毒載量、TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率與HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗有關。研究表明隨著母親HBV DNA病毒載量的增高，其分娩的新生兒接種HBV疫苗后出現免疫失敗的風險也隨之提高，即HBV感染孕產婦HBV DNA病毒載量越高，母嬰阻斷失敗的發生率也明顯增高[10]，與本研究結果類似，共同證實HBV感染孕產婦HBV DNA病毒載量與HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗相關。在HBV感染過程中TNF-α的表達與HBV感染患者病毒載量、HBeAg等密切相關，當機體TNF-α-308位點由G變為A等位基因時，機體內TNF-α-308位點周圍轉錄因子無法識別激活蛋白-2，TNF-α轉錄效率增加7倍左右，造成患者體內TNF-α表達異常，影響HBV感染后對病毒的清除作用。

3.2 TNF-α-308基因多態性與HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的關系

TNF-α是激活細胞因子體系的啟動因子，是誘導機體炎癥反應的重要介質，當機體組織發生損傷、感染等不良事件后，TNF-α在人體循環中迅速高表達，使人體內細胞級聯效應被激活，導致過度炎癥，使炎性細胞活化，加劇炎性反應，導致或加劇機體感染事件的發生[11]。本研究TNF-α-308 G/A位點基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，具有群體代表性。TNF-α-308基因多態性可能是通過機體激活蛋白-2與TNF-α基因的結合對其轉錄情況產生影響，激活蛋白-2具有明顯抑制TNF-α啟動因子活性的作用，進而影響TNF-α的表達，TNF-α-308位點長10bp的DNA片段可使激活蛋白-2得識別序列被激活，當TNF-α-308位點等位基因為G，激活蛋白-2可有效識別序列并相互結合，使TNF-α啟動因子的活性受到抑制，抑制TNF-α的表達，但當機體TNF-α-308位點由G變為A等位基因時，激活蛋白-2無法識別序列，進而影響TNF-α的表達，影響機體對HBV病毒的清除作用，增加了HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的風險[12]。

綜上所述，TNF-α-308基因多態性與HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗相關，HBV DNA病毒載量高、TNF-α-308 G/A位點A等位基因頻率是HBV感染孕產婦母嬰阻斷失敗的危險因素，但結果仍需多中心大樣本研究進一步驗證。