基于UPLC-MS/MS技術的張氏消腫定痛膏物質基礎研究

夏麗瓊，徐長瓊，任秋蕓，梅君，黎春輝，黎珊，唐奇，黃會保，李然

〔摘要〕 目的 研究了解張氏消腫定痛膏的藥效物質基礎。方法 基于液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術研究張氏消腫定痛膏中化學成分，并進行定性和相對含量分析。結果 基于廣泛靶向代謝組學技術，檢測到張氏消腫定痛膏中有542個化合物，其中種類最多的是黃酮類化合物122種，其次為酚酸77種;脂質的相對百分含量最高，為（24.01±4.23）%，黃酮類次之，為（17.95±3.01）%。結論 基于UPLC-MS/MS檢測平臺和MWDB數據庫，能簡單、高效檢測到張氏消腫定痛膏的化學物質基礎，為進一步明確其活性成分提供參考。

〔關鍵詞〕 張氏消腫定痛膏;超高效液相色譜-串聯質譜;黃酮;酚酸;脂質

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.010

Material Basis Reseach of Zhangs Antiswelling and Relieving Pain Ointment

Based on UPLC-MS/MS

XIA Liqiong1， XU Changqiong2， REN Qiuyun3， MEI Jun1， LI Chunhui1， LI Shan2， TANG Qi1， HUANG Huibao1*， LI Ran2*

（1. Pharmacy Department， Yueyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yueyang， Hunan 414000 China;

2. Scientific Research Institute， The Maternal and Child Health Hospital of Yueyang， Yueyang， Hunan 414000 China;

3. Medicine College， Shantou University， Shantou， Guangdong 515000 China）

〔Abstract〕 Objective To study the material basis of Zhangs antiswelling and relieving pain ointment. Methods Based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） technique， the chemical constituents in Zhangs antiswelling and relieving pain ointment were studied， and the qualitative and relative percentage analysis were conducted. Results UPLC-MS/MS detected 542 compounds were detected in Zhangs antiswelling and relieving pain ointment， among which 122 kinds of flavonoids were the most， followed by 77 kinds of phenolic acids， and the relative percentage of lipids were the highest （24.01±4.23）%， followed by （17.95±3.01）% of flavonoids. Conclusion Based on the UPLC-MS/MS technique， the chemical substance base of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment can be detected simply efficiently， which can provide reference for further defining its active ingredients.

〔Keywords〕 Zhangs antiswelling and relieving pain ointment; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; flavonoids; phenolic acids; lipid

“岳陽張氏正骨術”由張瑞林創立，歷經百余年理論發展及實踐驗證，成為湖湘中醫正骨的主流學派。2012年被國家中醫藥管理局確定為第一批全國十三大骨傷學術流派傳承工作室建設項目，2017 年獲評“湖南省非物質文化遺產代表性項目”。

“岳陽張氏正骨術”提倡內外相合用藥，百余年來積累了多種有效秘方，自擬自制過張氏消腫定痛膏、接骨止痛膠囊等10余種院內制劑。張氏消腫定痛膏是張氏正骨學術流派傳承人在中醫理論及張氏正骨學術思想指導下研制而成，由骨碎補、當歸、紅花、川芎、續斷、龍血竭、王不留行、梔子、大黃等25味中藥制成，在岳陽市中醫醫院及張氏正骨學術流派工作室臨床工作中，歷經20余年數萬例的臨床驗證，具有行氣、活血化瘀、消腫止痛的功效，對損傷軟組織無菌性炎癥的改變、局部急性炎癥的修復具有重要促進作用。用于治療急慢性軟組織損傷，臨床療效顯著，安全性良好[1-4]。然而，張氏消腫定痛膏治療骨傷科疾病的物質基礎研究尚不明確，本項目擬通過UPLC-MS/MS和MWDB數據庫等廣泛靶向代謝組學研究平臺，研究張氏消腫定痛膏化學成分，了解其化合物種類及相對含量，初步明確張氏消腫定痛膏發揮藥效作用的物質基礎。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，日本島津）;串聯質譜（Applied Biosystems 6500 QTRAP，美國SCIEX）;BSA224S-CW型電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）;甲醇、乙腈、乙醇為Merck色譜純試劑;標準品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）;色譜柱：Agilent RRHD SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;張氏消腫定痛膏由岳陽市中醫醫院骨傷科提供。

2 方法

2.1? 供試品溶液的制備

張氏消腫定痛膏原藥提取物制備：取各張氏消腫定痛膏原藥0.5 g，置15 mL離心管中，加甲醇10 mL，超聲提取1 h，加甲醇至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2? 測定條件

2.2.1? 液相條件? 流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈;洗脫梯度：0～9 min，5%～95% B;9～10 min，95% B;10～11 min，95%～5% B;11～14 min，5% B;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL。

2.2.2? 質譜條件? 電噴霧離子源（electrospray ionization， ESI）溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣（curtain gas， CUR）30 psi，碰撞誘導電離（collision-activated dissociation， CAD）參數設置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對根據優化的去簇壓（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy， CE）進行掃描檢測。

2.3? 代謝物定性定量分析

（1）代謝物定性：基于MWDB數據庫，根據二級譜信息進行物質定性，分析時去除了同位素信號，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復信號，以及本身是其他更大分子量物質的碎片離子的重復信號。

（2）代謝物定量：獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，用MultiaQuant軟件處理數據，進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應物質的相對含量，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。

2.4? 樣本質控分析

質控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復性。在儀器分析的過程中，每10個檢測分析樣本中插入一個質控樣本，以監測分析過程的重復性。

2.5? 數據處理

將所檢測物質按物質一級分類區分，得到所檢測到各類化合物總數量;將所有檢測到化合物峰面積相加定義為100%，計算單個色譜峰峰面積相對值，得該峰所對應化合物相對含量值，根據相對含量值比較每一類化合物總含量和該類化合物分布，列出部分相對含量較高或代表性化合物信息。

3 結果

3.1? 數據質控

利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據。樣品、混樣質控QC樣本的總離子流圖（total ions current， TIC）及MRM代謝物檢測多峰圖（多物質提取的離子流譜圖，XIC）見圖1。通過對不同質控QC樣本質譜檢測分析的總離子流圖進行重疊展示分析，可見該方法重復性及儀器穩定性良好，為數據的可靠性提供了重要的保障。

3.2? 張氏消腫定痛膏檢測化合物分類分析

張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物122種，酚酸77種，氨基酸及其衍生物42種，萜類40種，木脂素和香豆素40種，有機酸34種，生物堿33種，核苷酸及衍生物26種，脂質25種，醌類12種，鞣酸9種，維生素8種，糖及醇類5種，其他69種。見圖2A。

各類化合物總相對含量為脂質（24.01±4.23）%，黃酮（17.95±3.01）%，酚酸（13.37±1.79）%，木脂素和香豆素（7.38±1.27）%，氨基酸及衍生物（5.79±1.92）%，生物堿（5.49±1.73）%，有機酸占（3.96±0.78）%，核苷酸及衍生物（3.79±1.19）%，萜類（3.17±0.21）%，醌類（2.59±0.87）%，鞣酸（0.60±0.12）%，其他化合物（11.80±2.13）%。見圖2B。

將同類物質相對百分含量進行統計，其中脂質、黃酮和酚酸平均含量較高，最高含量化合物為綠原酸及其同分異構體。見圖2C。

3.3? 張氏消腫定痛膏主要成分

將每類物質相對含量進行排序，部分含量較高或部分代表性化合物。見表1。

在張氏正骨膏所測得化合物中，氨基酸及其衍生物、酚酸、核苷酸及其衍生物、黃酮、木脂素和香豆素、生物堿、萜類、有機酸、脂質、醌類和鞣質中含量最高化合物依次為L-精氨酸、綠原酸*、2-脫氧腺苷*、鈍葉素、石防風素、木蘭花堿、蛇藤酸、2-羥基十六烷酸、γ-亞麻酸*、大黃素和2，3-二-O-沒食子酰-D-葡萄糖，其他類化合物中狹葉墨西哥蒿素含量最高。

4 討論

通過UPLC-MS/MS和MWDB數據庫等廣泛靶向代謝組學研究平臺，在張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物種類最多，為122種，黃酮具有抗炎[5]、鎮痛[6-7]作用;酚酸類77種，酚酸具有重要的抗炎[8]和治療神經肌肉相關疾病[9]作用，與張氏消腫定痛膏適應癥較一致。相對百分含量分析中最多的為脂質，占（24.01±4.23）%，黃酮（17.95±3.01）%，酚酸（13.37±1.79）%;具體到化合物，含量超過1%的分別為綠原酸*、γ-亞麻酸*、α-亞麻酸*、亞油酸、L-精氨酸、肉豆蔻酸、狹葉墨西哥蒿素、紫檀芪等。在列表中主要化合物來源與方劑中藥材組成具有一定對應關系，如續斷、當歸、川芎、王不留行、紅花、羌活、威靈仙中均含綠原酸[10-17];大黃中含大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、沒食子酸等[18-19];白芷中氧化前胡素水合物、白當歸素[20-21];紅花中羥基紅花黃色素A[22];當歸、川芎中川芎內酯A、川芎內酯 I、川芎內酯 F、川芎內酯 H、阿魏酸[23-25];王不留行中肥皂草苷（異牡荊素-7-葡萄糖苷）、氫化阿魏酸[26-27];骨碎補中新北美圣草苷[28];梔子中藏紅花素1[29];劉寄奴中含異澤蘭黃素、狹葉墨西哥蒿素、異鼠李素、奇蒿黃酮等。本研究結果表明，基于UPLC-MS/MS技術對于復雜的中藥復方物質基礎研究具有簡單、高效的特點;但也存在一定不足，如定性分析因儀器分辨率限制或化合物性質原因，分析準確性存在一定出入，部分同分異構體未能進行結構區分，后續研究中有待對主要化合物進行進一步驗證;本文定量分析采用的是峰面積積分，但存在不同化合物在固定質譜條件下響應差異，導致峰面積歸一法不能較精確反映實際含量，后續需使用標準品對主要成分進行準確定量分析。該項目研究結果為我們篩選張氏正骨膏主要化合物進行更深入研究提供了一定研究基礎。

參考文獻

[1] 黃會保，陳輝明，彭? 亮.岳陽張氏正骨氣血理論之以氣為先[J].湖南中醫藥大學學報，2016，36（1）：47-48.

[2] 黃會保，張婉妮.岳陽張氏正骨流派學術思想探微[J].湖南中醫雜志，2016，32（4）：90-91.

[3] 張? 偉，彭? 亮，黃會保.試論岳陽張氏正骨學術思想的“和”文化內涵[J].湖南中醫雜志，2015，31（11）：8-9，12.

[4] 謝仁明，黃會保，陳輝明，等.岳陽張氏正骨術的流派傳承與發展[J].中國中醫骨傷科雜志，2016，24（9）：72-73，77.

[5] CHEN G Y， CHEN J Q， LIU X Y， et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine， 2021， 2021： 1-14.

[6] RAO P N， MAINKAR O， BANSAL N， et al. Flavonoids in the treatment of neuropathic pain[J]. Current Pain and Headache Reports， 2021， 25（7）： 1-10.

[7] ALGHAMDI S. Antinociceptive effect of the Citrus flavonoid eriocitrinon postoperative pain conditions[J]. Journal of Pain Research， 2020， 13： 805-815.

[8] ALI S S， AHMAD W A N W， BUDIN S B， et al. Implication of dietary phenolic acids on inflammation in cardiovascular disease[J]. Reviews in Cardiovascular Medicine， 2020， 21（2）： 225-240.

[9] KOZA L A， WINTER A N， HOLSOPPLE J， et al. Protocatechuic acid extends survival， improves motor function， diminishes gliosis， and sustains neuromuscular junctions in the hSOD1G93A mousemodel of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Nutrients， 2020， 12（6）： 1824.

[10] 彭支蓮，張? 丹，李業洪，等.正交法優選續斷中綠原酸的提取工藝[J].江蘇農業科學，2013，41（7）：269-270.

[11] 張? 丹，陶燕鐸，曹緯國，等.重慶產續斷中總酚酸與綠原酸的含量測定[J].中國醫院藥學雜志，2011，31（17）：1463-1465.

[12] 李偉霞，唐于平，尚爾鑫，等.當歸、川芎和歸芎藥對中主要芳香酸類成分在血虛大鼠體內的代謝研究[J].中華中醫藥雜志，2013，28（5）：1212-1218.

[13] 朱邵晴，郭? 盛，錢大瑋，等.基于多元功效成分的當歸藥材產地現代干燥加工方法研究[J].中國中藥雜志，2017，42（2）：264-273.

[14] 袁德俊，吳? 涵，梁馨文，等.不同批次廣東王不留行蘆丁和綠原酸的含量比較[J].廣西中醫藥，2019，42（4）：56-59.

[15] Bulgantuya Bumandorj， Narantsetseg Byambaakhuu， 葉日貴，等.紅花的抗氧化活性成分研究[J].內蒙古大學學報（自然科學版），2015，46（3）：301-307.

[16] 劉? 洋，郭慧清，楊? 樂，等.3種商品規格羌活體內外抗炎作用差異與譜效關系研究[J].中草藥，2019，50（24）：6052-6058.

[17] 許晨新.威靈仙水溶性成分及其體外透皮行為研究[D].淮陰：淮陰工學院，2020.

[18] 閆海燕.HPLC法測定大黃提取物中蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量[J].化學與生物工程，2012，29（10）：87-88，94.

[19] 朱詩塔，李新中，雷? 鵬，等.不同煎煮法對大黃沒食子酸含量的影響及與小腸推進作用的相關性[J].中南藥學，2008，16（6）：714-717.

[20] 張? 平，馬? 瀟，李冬華，等.白芷飲片全國評價性抽驗結果分析與多指標成分一測多評法研究[J].中草藥，2019，50（14）：3329-3336.

[21] 邊文海，張倩，王世祥.高效液相色譜法測定中藥白芷中三種香豆素的腸吸收[C]//第二十屆全國色譜學術報告會及儀器展覽會論文集.西安，2015：53-54.

[22] 羅? 晶，黃宇玫，曾文雪.紅花中羥基紅花黃色素A的提取工藝及其熱穩定性研究[J].江西中醫學院學報，2009，21（5）：39-42.

[23] 陳? 冉，尹丹丹，楊? 沫，等.超高效液相色譜法比較鮮川芎和川芎藥材中6種成分含量[J].安徽中醫藥大學學報，2019，38（6）：84-88.

[24] 宋秋月，付迎波，劉? 江，等.當歸的化學成分研究[J].中草藥，2011，42（10）：1900-1904.

[25] 熊耀坤，梁? 爽，洪燕龍，等.應用反相高效制備液相同時分離川芎中阿魏酸、洋川芎內酯I和H[J].中國中藥雜志，2013，38（12）：1947-1950.

[26] 魯? 靜，林一星，馬雙成.中藥王不留行中刺桐堿和異肥皂草苷分離鑒定和測定[J].藥物分析雜志，1998，18（3）：.

[27] 桑圣民，勞愛娜，王洪誠，等.中藥王不留行化學成分的研究（Ⅱ）[J].中草藥，2000，31（3）：169-171.

[28] 李曉紅，熊志立，虞明陽，等.基于主成分分析的骨碎補藥材乙醇和環己烷提取物的高效液相色譜指紋圖譜及指標成分的定量分析[J].色譜，2009，27（4）：453-457.

[29] 陳? 哲，趙慶生，秦? 雯，等.藏紅花素I的分離制備及抗氧化與穩定性研究[J].食品研究與開發，2018，39（24）：63-70.

（本文編輯? 蘇? 維）