基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預測大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征的抗炎作用機制

馮俊芳，王一彪，陳歐，高雁翎

1.德州市人民醫(yī)院新生兒科，山東 德州 253000；2.山東大學齊魯醫(yī)學院第二醫(yī)院兒科，山東 濟南 250033；3. 山東大學齊魯醫(yī)學院護理學院，山東 濟南 250012

新生兒急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是不同病因引起的肺部急性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、低氧血癥、肺順應(yīng)性下降等癥狀，是新生兒常見的臨床危重癥。新生兒ARDS的病因是肺內(nèi)外多種炎癥導致的肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)繼發(fā)性缺乏，發(fā)病具有炎癥性特點[1-2]。大黃酸是大黃等中藥的主要活性成分之一，屬單蒽醌類1,8-二羥基蒽醌衍生物，有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等藥理活性[3-5]。目前，大黃酸通過抗炎作用治療急性呼吸窘迫綜合征報道較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(network pharmacology)是一門藥理學分支學科，它采用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證等方法，構(gòu)建藥物、疾病和生物分子相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模型，為辨識藥物的靶標、藥物開發(fā)指導奠定基礎(chǔ)[6]，它被認為是“下一代藥物研究新模式”。“藥物-靶點-通路及疾病-基因-靶點-藥物”等生物分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建則是網(wǎng)絡(luò)藥理學的基礎(chǔ)[7-8]，它既可以從成分-靶點-通路探討藥物療效，也可以通過已知療效的藥物反向探索疾病發(fā)病機制[9-10]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預測大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征的抗炎作用機制，并通過細胞水平的實驗加以驗證，為治療新生兒ARDS提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 使用的工具和數(shù)據(jù)來源采用TCMSP、PubChem、STITCH 查找藥物的化學成分及其作用的靶標；通過Genebank、TTD、Drugbank、String查找與疾病相關(guān)的基因，基因之間的相互作用及蛋白-蛋白相互作用信息；應(yīng)用Enrichr、KEGG 查找生物分子參與的信號通路；用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；用Systemsdock進行分子對接。

1.2 大黃酸靶點的預測通過查詢TCMSP 及PubChem數(shù)據(jù)庫，得到并導出大黃酸的三維化學結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)導入Swiss prediction target數(shù)據(jù)庫中進行反向分子對接，靶點集選擇“homo sapiens”，得到預測靶點，用于后續(xù)研究。

1.3 大黃酸-靶蛋白分子對接通過查詢PDB數(shù)據(jù)庫，得到靶點蛋白的PDB-ID，并將其導入Systemsdock進行分子對接，根據(jù)Docking Score值來判斷大黃酸與靶點的匹配度。Score 取值范圍在0～10 之間，值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定[11]。

1.4 大黃酸-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape軟件，將大黃酸及其潛在靶點導入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物-靶蛋白”互作信息網(wǎng)絡(luò)。

1.5 大黃酸-靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的相互作用是人類生命活動的基礎(chǔ)，也是探索人體分子機制的重要內(nèi)容。為了明確藥物靶點之間的相互作用，本研究應(yīng)用STRING 平臺篩選靶點之間的相互作用，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)的角度研究疾病分類，確定機制，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點。應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫平臺，構(gòu)建大黃酸靶蛋白-靶蛋白之間的相互作用信息網(wǎng)絡(luò)(PPI network)，蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，閾值設(shè)為“medium confidence”，其余參數(shù)均保持默認值。

1.6 抗炎相關(guān)靶點蛋白信息篩選在Therapeutic Target Database (TTD)數(shù)據(jù)庫中，將關(guān)鍵詞設(shè)置為“anti-inflammation”，搜索抗炎靶點蛋白相關(guān)信息。將選取的抗炎靶點蛋白輸入Cytoscape軟件中，構(gòu)建抗炎靶點蛋白-蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 大黃酸抗炎靶點的篩選及抗炎靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將大黃酸靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)與選取的抗炎靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)合并，取其交集，交集中的靶點蛋白即為大黃酸的抗炎靶點蛋白，并將上述靶點蛋白輸入String 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)置蛋白相互作用的高置信度依據(jù)：打分值＞0.7。

1.8 檢索新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因在NCBIGene 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nim.nih.gov)中，新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因以“Neonatal respiratory distress syndrome”和“homo sapiens”為關(guān)鍵詞進行檢索，得到新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)的基因。

1.9 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)在String數(shù)據(jù)庫中輸入大黃酸抗炎靶點基因與新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)基因，構(gòu)建大黃酸抗炎靶點對抗新生兒呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，進一步篩選與新生兒呼吸窘迫綜合征發(fā)病相關(guān)的抗炎靶點。

1.10 KEGG 通路富集分析在Enrichr 數(shù)據(jù)庫中，對大黃酸干預新生兒呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵作用靶標進行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物通路富集分析。

1.11 體外實驗驗證大黃酸抗新生兒ARDS作用的分子機制

1.11.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理HBE細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自Sigma公司。LPS購自Sigma公司。p-P38、P38抗體購自ABclonal 公司。本實驗在山東大學第二醫(yī)院中心實驗室完成。將HBE 細胞置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞增殖到約80%時傳代繼續(xù)培養(yǎng)。細胞分為5 組：HBE 對照組、LPS 聯(lián)合OVA組、大黃酸低劑量組(0.1 μmol/L)、大黃酸中劑量組(0.5 μmol/L)、大黃酸高劑量組(1.0 μmol/L)。

1.11.2 Western blot 檢測p-P38 及P38表達收集待測HBE 細胞，用PBS 洗3 次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，提取細胞總蛋白。等量的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 凝膠(10%)電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的牛奶(MILK)進行封閉，然后依次孵育一抗(抗p-P38、抗P38抗體)和二抗，最后進行顯色。蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值的比值。

1.12 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 7 進行統(tǒng)計學分析，ImagJ 計算目的蛋白灰度值，ONE-WAY ANOVA檢驗進行方差分析，檢測數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，柱狀圖采用GraphPad Prism 7軟件繪制；檢驗水準α=0.05，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸與預測靶點網(wǎng)絡(luò)通過查詢TCMSP、PubChem、Swiss prediction target 數(shù)據(jù)庫篩選出10 個大黃酸的靶點蛋白，并運用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建大黃酸-預測靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 大黃酸-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 大黃酸靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)選取大黃酸的10 個靶點蛋白，在String 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖2)，組成15條相互作用關(guān)系，見圖2。

圖2 大黃酸靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 大黃酸與相關(guān)靶點的反向?qū)拥梅譃檫M一步驗證預測靶點的準確性，選取大黃酸與12個度數(shù)最高的靶蛋白進行分子對接分析。其結(jié)果顯示，大黃酸與靶蛋白對接的score值均大于5，表明大黃酸與預測靶點具有良好的相互作用，證實了預測靶點的可靠性，見表1。

表1 大黃酸與其靶點的對接得分

2.4 大黃酸-抗炎靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析在TTD中檢測到70 個與抗炎相關(guān)的蛋白，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，在PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3)中，共有63 個相互作用靶點，組成383條相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.7.1 中的Merge 功能將大黃酸預測靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)與抗炎靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)融合，取其交集部分(圖4)，取＞0.7的高置信度區(qū)間，得到大黃酸發(fā)揮抗炎作用靶點，包括腫瘤壞死因子受體超家族成員1A (TNFRSF1A)、表皮生長因子受體(EGFR)、受體酪氨酸激酶Erb-B2 (Erb-B2)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14)。

圖4 大黃酸預測靶點-抗炎靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒急性呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果得到4個與新生兒急性呼吸窘迫綜合征相關(guān)的大黃酸抗炎靶點：TNFRSF1A 、EGFR、Erb-B2、及MAPK14，見圖5。

圖5 大黃酸抗炎靶點對抗新生兒急性呼吸窘迫綜合征的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)

2.6 大黃酸治療新生兒ARDS 的KEGG 通路富集分析通路富集分析結(jié)果得出大黃酸治療新生兒急性呼吸窘迫綜合征主要涉及128條信號通路。將Enrichr分析結(jié)果按P 排序排名前十的KEGG通路：免疫信號通路MAPK 信號通路、Human cytomaglovirus infection、Proteoglycans in cancer、Bladder cancer、Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)、Endometrial cancer、Central carbon metabolism in cancer、Non-small cell lung cancer、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection 及Adherence junction，見圖6。

2.7 大黃酸對LPS 聯(lián)合OVA 誘導的HBE 細胞p38MAPK通路表達和炎癥反應(yīng)的影響圖7顯示，與對照組相比較，LPS聯(lián)合OVA組HBE細胞中p-P38相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與LPS聯(lián)合OVA組相比較，大黃酸0.1 μmol/L組、大黃酸0.5 μmol/L 及大黃酸1.0 μmol/L 組中p-P38 相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

ARDS 是一種肺部急性炎癥性疾病[1]，其主要病理改變?yōu)榉尾垦仔约毎?、肺泡上皮屏障破壞及肺泡血管?nèi)皮滲透性增加等，臨床表現(xiàn)為嚴重低氧血癥、呼吸窘迫、肺順應(yīng)性下降等癥狀。近年來，足月兒ARDS發(fā)病率逐漸增加，且其具有病情重、進展快和病死率高等特點[12]。目前，新生兒ARDS的治療原則仍以糾正缺氧、降低肺動脈高壓、治療原發(fā)病等綜合治療為主，但尚無特效的治療手段。因此，尋找新的治療呼吸窘迫綜合征的藥物及靶點顯得尤為重要。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的相關(guān)方法，建立中藥成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，從整體的觀點深入探究大黃酸治療新生兒ARDS的相關(guān)作用機制，并通過體外實驗進行驗證。

文獻報道大黃酸具有抗炎作用活性[13-15]，徐佑東等[16]從分子機制方面證實了大黃酸的抗炎作用。本研究結(jié)果顯示了大黃酸的抗炎作用，與上述結(jié)論一致。一方面，網(wǎng)絡(luò)藥理學預測得出TNFRSF1A、EGFR、Erb-B2、MAPK14 是大黃酸藥物的抗炎靶點；另一方面，TNFRSF1A、EGFR、Erb-B2、MAPK14 與疾病新生兒呼吸窘迫綜合征相關(guān)。由此推測，這4 個靶點可能是大黃酸治療新生兒呼吸窘迫綜合征的重要抗炎靶點。大黃酸既可以直接作用于這些靶點發(fā)揮抗炎作用，也可以間接作用于其他靶點而發(fā)揮抗炎作用[17]。

TNFRSF1A 是1 型TNF 受體，屬腫瘤壞死因子受體超家族成員，在機體內(nèi)分布廣泛。TNFRSF1A主要通過活化NF-κB、JAK-STAT、MAPK等信號通路[18]，誘導細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α等的合成及細胞凋亡而介導炎癥反應(yīng)[19-21]。TNFRSF1A也可與MAPK14共同參與腫瘤壞死因子等信號通路發(fā)揮作用。

EGFR是表皮生長因子受體，廣泛分布于機體上皮組織中，在炎癥發(fā)生過程中起重要調(diào)節(jié)作用[22]。體外實驗證實，EGFR抑制劑可通過調(diào)控NF-κB信號通路，抑制LPS誘導的iNOS表達，抑制細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[23]。小鼠支氣管上皮EGFR磷酸化水平與臭氧誘導的小鼠肺組織炎癥病理學變化總分呈正相關(guān)[24]。補肺益腎方可通過調(diào)控EGFR/PI3K/mTOR 通 路，降 低 促 炎 因 子IL-1 β 、IL-6、TNF-α等的水平，減輕COPD氣道炎癥[25]。在KEGG通路富集前十位信號通路中，其中的9 種信號通路均有EGFR參與，也進一步說明了大黃酸可通過與EGFR及其相關(guān)信號通路構(gòu)建成作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮其抗炎作用。

Erb-B2 又名HER2、NEU、CD340，是原癌基因erb-B2編碼的185 kDa的細胞膜受體，為EGFR家族成員之一[26]。小鼠細胞因子IL-1、腫瘤壞死因子、IFN-γ等的激活促進了乳腺癌的發(fā)生及進展[27]。抑制或敲除Erb-B2 可以通過調(diào)控NF-κB 信號通路影響IL-1β、Cyclooxygenase-2 和多種趨化因子的表達，進而減輕紫外線誘導的皮膚炎癥反應(yīng)[28]。由此推測大黃酸通過與Erb-B2 相互作用可能通過調(diào)節(jié)IL-1β、TNF、IFN-γ的分泌發(fā)揮抗炎作用。

MAPK14 是P38MAPKs 之一，p38 MAPK 亞群包括4種亞型，分別為p38α、p38β、p38γ、p38δ，其中p38α和p38β主要參與炎性紊亂[29]。促炎細胞因子或細胞外刺激可引發(fā)細胞級聯(lián)反應(yīng)，P38MAPKs 在上述所引發(fā)的細胞級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用，在重癥胰腺炎、激素抵抗型哮喘等疾病中的表達量明顯升高[30-31]，并且P38MAPKs 是由肺炎鏈球菌所引發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子[32]，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子可以通過激活p38MAPK 信號通路，與ERK 及核因子-κB (NF-κB)等信號通路發(fā)生正反饋，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)[33]。由P38MAPKs調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)會導致TNF-α、IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，進而導致炎癥反應(yīng)相關(guān)酶的激活[34]，在LPS 誘導的急性肺損傷小鼠中Dapk1 可通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB 通路降低IL-6、TNF-α、MPO等細胞因子的水平，減輕炎癥反應(yīng)[35]。由此推測，大黃酸可通過減低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表達，抑制MAPK通路，發(fā)揮其抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，在OVA 聯(lián)合LPS 誘導的HBE 細胞中MAPKP38的磷酸化水平升高，給予大黃酸治療后可以降低MAPKP38的磷酸化水平，并且與大黃酸濃度成正相關(guān)。這說明，大黃酸的抗炎作用可能與調(diào)控MAPK通路有關(guān)，與上述結(jié)論一致。本實驗采用基于網(wǎng)絡(luò)藥理學原理的綜合數(shù)據(jù)分析方法，預測了大黃酸抗炎作用的主要靶點及相關(guān)的信號通路，發(fā)現(xiàn)大黃酸可通過多靶點、多途徑干預新生兒急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生、發(fā)展，并且運用體外實驗驗證了大黃酸抗炎作用的相關(guān)分子機制。但網(wǎng)絡(luò)藥理學研究以網(wǎng)絡(luò)建模、數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)以及軟件應(yīng)用為基礎(chǔ)，網(wǎng)絡(luò)模型及細胞實驗與機體內(nèi)環(huán)境存在一定差異，故大黃酸抗炎作用的研究結(jié)果還需通過進一步的體內(nèi)實驗加以證實。