芝麻酚對模型小鼠肝損傷的改善作用*

謝允東，王小平，何世鵬

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西咸新區(qū)712046；2.上海大學，上海200444）

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬黃獨Dioscorea bulbiferaL.多年生草質纏繞藤本植物的地下塊莖，藥用歷史悠久，味辛、苦，性涼，有小毒，歸肝、胃、心、肺經(jīng)，具有解毒消腫、化痰散結、涼血止血功效［1－2］。內服用于治療甲狀腺腫大、淋巴結結核、咽喉腫痛、吐血、咯血、百日咳、癌腫；外用可治療瘡癤［3－4］。黃藥子療效確切，但隨著其臨床應用的增加，主要不良反應肝損傷［5－7］逐漸顯現(xiàn)，從而限制了其臨床應用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藥子誘導的肝損傷與氧化應激和炎性損傷有關。芝麻酚是芝麻中的有效成分，具有較好的抗氧、抗炎等作用［8－10］。本研究中探討了芝麻酚對黃藥子誘導小鼠肝損傷的改善作用及其機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：DYY－PAGE型電泳儀、DYCP－40C型轉移槽（北京六一儀器廠）；WD－9405F型水平搖床（北京六一儀器廠）；Smart Plus－N型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；H1850型超速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；ELX808型全波長酶標儀（美國BioTek公司）；DH43L型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

試藥：黃藥子（陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，批號為20190920）；芝麻酚（批號為D050385），水飛薊素（批號為D110160），購自上海安耐吉試劑公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20201211），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號為20201128），還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號為20201105），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20201208），均購自南京建成生物工程研究所；全蛋白提取試劑盒（批號為WLA019），核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號為WLA020a），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號為WLA004），SDS－PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號為WLA013），ECL發(fā)光液（批號為WLA003），核轉錄因子κB（NF－κB）p65抗體（批號為WL01273b），p－NF－κBp65抗體（批號為WL02169），核因子E2相關因子2（Nrf2）抗體（批號為WL012135），血紅素加氧酶－1（HO－1）抗體（批號為WL02400），腫瘤壞死因子－α（TNF－α）抗體（批號為WL01581），白細胞介素6（IL－6）抗體（批號為WL02841），羊抗兔IgGHRP（批號為WL023），內參抗體Histone H3（批號為WL0984a），內參抗體β－actin（批號為WL01372），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；PVDF膜（美國Millipore公司，批號為IPVH00010）。

動物：SPF級健康KM小鼠48只，雄性，體質量（20±2）g，購于成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020－030，動物使用許可證號SYXK（陜）2017－004，實驗動物合格證號0043206。飼養(yǎng)條件，SPF級實驗室，溫度22～24℃，相對濕度45%～65%。本動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審批，按要求開展。

1.2 方法

黃藥子提取物制備：取黃藥子飲片適量，粉碎得粗粉，浸泡2 h后用8倍量75%乙醇溶液回流提取，每次4 h，提取3次，合并醇提液，濃縮并減壓干燥，得干粉，備用。

分組及給藥：將48只小鼠分為正常對照組（等體積0.2%CMC－Na溶液）、模型組（等體積0.2%CMC－Na溶液）、水飛薊素組（200 mg／kg）及芝麻酚低、中、高劑量組（6，12，24 mg／kg）。正常對照組小鼠僅灌胃等體積0.2%CMC－Na溶液，其余各組小鼠灌胃相應藥物及黃藥子75%乙醇提取物（18 g／kg），每日1次，持續(xù)30 d。

1.3 檢測指標

血漿生化指標：給藥30 d后，小鼠禁食不禁飲12 h，之后眼眶取血，置帶抗凝劑的EP管中，冰浴靜置30 min，4℃條件下4 000 r／min離心10 min，取上層血漿，－20℃保存，待測。采用全自動生化分析儀測定小鼠血漿中天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBiL）水平。檢測小鼠血漿中SOD，CAT，GSH，MDA水平。

組織病理學：小鼠眼眶取血后處死，解剖，取肝臟，去除多余的瘀血和結締組織，將部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛溶液中，72 h后依次進行包埋切片、切片脫蠟至水、蘇木素－伊紅（HE）染色、脫水、透明、封片，光鏡下觀察肝組織病理變化。

肝組織分子生物學：取肝臟，在液氮中研磨，加入1mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿，每隔5 min超聲20 s。裂解30 min后，4℃條件下12 000 r／min離心20 min，取上清液，以BCA法檢測蛋白含量。各組取20 μg上樣，10% SDS－PAGE電泳后濕法電轉，恒流250 mA冰上轉膜90 min至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST清洗3次，加入NF－κBp65，p－NF－κBp65，Nrf2，HO－1，TNF－α，IL－6（1∶500），Histone H3，β－actin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜。回收一抗，TBST清洗3次，加入二抗（1∶5 000）37℃條件下孵育45 min，用TBST清洗3次。加入ECL化學發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Gel－Pro－Analyzer軟件將條帶灰度值數(shù)字化，以目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad Prism 8.0軟件繪制檢測結果的柱狀圖。

2 結果

2.1 肝臟組織病理學

肝臟組織HE染色顯示，正常對照組小鼠肝臟肝板呈放射狀，肝細胞正常，邊緣清晰，肝細胞核正常；模型組小鼠肝細胞腫脹，炎性因子浸潤，邊緣清晰，部分肝細胞核溶解。水飛薊素組肝細胞腫脹、浸潤，損傷等狀況明顯改善。芝麻酚低、中、高劑量組細胞腫脹降低，浸潤減少，肝細胞損傷明顯改善，隨著劑量的升高，改善作用更好。結果見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理切片（HE，×200）A.Normal control group B.Model group C.Silymarin group D－F.Low－dose，medium－dose，high－dose sesamol groups Fig.1 Pathological sections of liver tissues of mice in each group（HE，×200）

2.2 肝功能指標

與正常對照組比較，模型組小鼠血漿中ALT，AST，TBiL水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚低、中、高劑量組小鼠血漿中ALT，AST，TBiL水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組小鼠肝功能指標檢測結果（±s ，n＝8）A.ALT B.AST C.ALP D.TBiLNote：group a is normal control group，group b is model group，group c1－c3 are low－dose，medium－dose，high－dose sesamol groups respectively，group d is silymarin group；compared with those in group a，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；compared with those in group b，*P＜0.05，**P＜0.01；as well as the following figures.Fig.2 Test results of the liver function indexes of mice in each group（±s，n＝8）

2.3 抗氧化指標

與正常對照組比較，模型組小鼠血漿中SOD，CAT，GSH水平均顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚高劑量組小鼠血漿中SOD和CAT水平均顯著升高，芝麻酚高、中劑量組GSH水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），水飛薊素組和芝麻酚高、中、低劑量組MDA水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖3。

圖3 各組小鼠抗氧化指標檢測結果（±s，n＝8）A.SOD B.CAT C.GSH D.MDAFig.3 Test results of the antioxidant indexes of mice in each group（±s，n＝8）

2.4 肝組織勻漿炎性指標

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達水平均顯著升高，Nrf2和HO－1蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚低、中、高劑量組小鼠肝組織勻漿中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達水平均顯著降低，Nrf2和HO－1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），且呈劑量依賴關系。結果見圖4。

圖4 芝麻酚對黃藥子誘導肝損傷小鼠肝組織勻漿相關因子、蛋白表達水平（n＝3）A.p－NF－κBp65 B.TNF－α C.IL－6 D.Nrf2 E.HO－1Fig.4 Effect of sesamol on the expression of related factors and proteins in liver tissues of mice with liver injury induced by Rhizoma Dioscoreae Bulbiferae（n＝3）

3 討論

黃藥子對甲狀腺疾病等有顯著臨床療效，但長期或大劑量服用會導致肝損傷，其損傷機制與氧化應激密切相關［11］。黃藥子作用于肝細胞誘發(fā)產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），并累積于肝細胞內，過量ROS的產(chǎn)生超出了抗氧化體系的抗氧化能力，氧化應激還可能通過免疫激活釋放炎性因子直接介導肝細胞的凋亡和肝竇內皮細胞損傷，導致肝臟炎癥和細胞壞死［12－13］。本研究結果表明，小鼠給予黃藥子75%乙醇提取物后，肝功能指標ALT，AST，TBiL水平均顯著升高，而給予芝麻酚干預后能顯著降低上述指標水平，說明芝麻酚對黃藥子誘導的小鼠肝損傷具有改善作用。肝臟組織病理切片實驗結果進一步說明芝麻酚對黃藥子誘導的肝損傷有改善作用。

NF－κB與機體炎性反應關系密切［14－15］，磷酸化后進入細胞核調控下游系列炎性因子的表達。本研究結果顯示，給予黃藥子提取物后，小鼠肝組織中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達水平均顯著升高，說明肝組織產(chǎn)生了炎性反應。給予芝麻酚干預后，p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達水平均顯著下降，說明芝麻酚對黃藥子誘導小鼠肝臟產(chǎn)生的炎性反應有顯著抑制作用，可能與其抑制NF－κB磷酸化有關。Nrf2是調控細胞氧化損傷的關鍵轉錄因子，可與抗氧化物元件（ARE）結合調控抗氧化物的表達，Nrf2被激活可誘導其下游HO－1的表達及其他的抗氧化酶的表達［16－17］。本研究結果顯示，給予黃藥子75%乙醇提取物后，血漿中抗氧化酶SOD，CAT，GSH水平均顯著降低，脂質過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著增加，肝組織中Nrf2和HO－1表達水平均顯著下調，說明黃藥子75%乙醇提取物誘導小鼠產(chǎn)生了氧化應激，給予芝麻酚干預后，抗氧化酶水平顯著升高，脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著減少，肝組織中Nrf2和HO－1表達水平顯著升高，說明芝麻酚對黃藥子誘導小鼠產(chǎn)生的氧化應激具有改善作用，可能與其激活Nrf2蛋白后增強機體的抗氧化酶有關。

綜上所述，芝麻酚對黃藥子75%乙醇提取物誘導的小鼠肝損傷具有一定防護作用，其作用機制可能與調節(jié)Nrf2／NF－κB信號通路而提高機體的抗氧化和抗炎能力有關。