基于UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術的血藤果化學成分分析*

熊 佩，李凱琳，龔開妍，史思林，彭 婕，吳衛華，2，3△，蔡 偉，2，3

（1.湖南醫藥學院藥學院，湖南 懷化418000；2.湖南醫藥學院侗醫藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化418000；3.湖南醫藥學院新型抗體藥物及其智能運輸系統湖南省重點實驗室，湖南 懷化418000）

血藤果為木蘭科植物厚葉五味子Kadsura coccinea（Lem）A.C.Smith的干燥成熟果實［1］，又名冷飯團、布福娜、香繡球、福星果、足球果［2］，是集食用、藥用、綠化、觀賞于一體的多用途水果，開發潛力較大。其多生于江西、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地，秋末冬初果實成熟后采收，干燥或鮮用，具有祛風活絡、調經止痛、益腎固精、補血養顏等功效，常用于婦女圍絕經期綜合征、產后出血、婦女不孕［1］。現有文獻對黑老虎的研究多集中于根莖部，發現的化學成分主要包括木質素類和三萜類，以及單萜類、倍半萜類、甾體類、氨基酸等［3］。血藤果作為黑老虎的果實，僅有少量文獻通過系統預算法對其可能的化學成分進行預試驗，僅能初步判定其可能的化學成分［4］。本試驗中采用超高效液相色譜串聯四極桿軌道阱質譜（UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS）技術結合超高效液相色譜快速高效的分離能力與質譜高特異性、高靈敏度的分析能力，同時根據各對照品的標準圖譜，各色譜峰的一級、二級質譜數據及相關數據庫和參考文獻，對血藤果的化學成分進行快速分析、鑒定，為血藤果的后續開發提供基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Q－Exactive型四極桿－靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Dionex UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國Dionex公司），DJB1200型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；KQ－300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

檸康酸（批號為GE6650000），酒石酸（批號為2018042074），對羥基苯甲醛（批號為DH1925000），順式烏頭酸（批號為20190512），均購自山東西亞化學工業有限公司，含量均大于98%；奎寧酸（上海源葉生物科技有限公司，批號為A06N11L130218，含量＞98%）；檸檬酸（批號為C108869），L－（－）－蘋果酸（批號為M105695），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量均大于98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級／質譜級；水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；血藤果藥材采自湖南省懷化市通道縣，經湖南醫藥學院藥學院蔡偉副教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil GOLDTMaQ柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）－0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min時100%A，2～5 min時100%A→98%A，5～20 min時98%A→85%A）；流速為0.3 mL／min；進樣量為1 μL；柱溫為40℃。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式下噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣壓力為35 arb，輔助氣壓力為10 arb，離子傳送管溫度為320℃，干燥氣溫度為350℃，S－lens RF level為60，分辨率為35 000，掃描范圍為m／z100～800；負離子模式下噴霧電壓為3.2 kV，鞘氣壓力為35arb，輔助氣壓力為10arb，離子傳送管溫度為320℃，干燥氣溫度為350℃，S－lens RF level為60，分辨率為35 000，掃描范圍為m／z100～800。

2.2 溶液制備

分別取檸康酸、酒石酸、檸檬酸、L－（－）－蘋果酸、奎寧酸、對羥基苯甲醛、順式烏頭酸對照品適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，制成單一對照品貯備液；按一定比例混合，即得混合對照品溶液。稱取冷凍干燥后的藥材樣品1.0 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入50%甲醇10 mL，超聲（功率為800 W，頻率為40 kHz）提取1 h，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。50%甲醇經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得陰性對照品溶液。

2.3 成分分析

2.3.1 篩選

在正離子掃描模式下篩選出28個化學成分，在負離子掃描模式下篩選出25個成分，共51個化學成分，其中43個化學成分為首次從血藤果中鑒定得到。各化學成分的保留時間、準分子離子峰質荷比的實測值與理論值、二級碎片離子信息見表1［5－18］，其正、負離子掃描模式下高分辨提取離子流圖見圖1，UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術首次鑒定到的血藤果中43個化學成分的化學結構見圖2。

圖2 血藤果藥材中首次鑒定到的43個化學成分結構式Fig.2 Chemical structures of 43 constituents identified from Kadsura Coccinea Fructus for the first time

表1 血藤果藥材中化學成分信息Tab.1 Identification of chemical constituents in Kadsura Coccinea Fructus

2.3.2 正負離子模式下同時鑒定

化合物3、化合物7在正負離子模式下均被檢測出，結合文獻［5］報道，分別鑒定為天冬酰胺、谷氨酸。

2.3.3 正離子模式下鑒定

正離子模式下，峰30、峰38的保留時間不同而準離子峰相同，通過與檸康酸標準品質譜行為進行對比確認，鑒定為對羥基苯甲醛的同分異構體。

峰2、峰19的保留時間不同而準離子峰及二級碎片離子相同，結合文獻［5－6］報道，分別鑒定為D－精氨酸、L－精氨酸。

峰5、峰18的保留時間不同而準離子峰及二級碎片離子相同，其中碎片離子m／z110.071 5［M＋HH2O－CO］－是通過失去1個CO2和1個H2O所得，結合文獻［5－6］報道，分別鑒定為D－組氨酸、L－組氨酸。

峰14和峰26保留時間不同但均產生準離子峰144.101 8［M＋H］＋及碎片離子m／z98.096，結合文獻［9］報道內容，分別鑒定為水蘇堿及其同分異構體。

峰15與峰25的保留時間不同但均產生相同準離子峰，得到相同二級碎片離子m／z80.050 0，結合文獻［8］報道，分別鑒定為煙酸及其同分異構體。

峰16與峰28的保留時間不同但均產生相同準離子峰，并通過失去1個NH3得到碎片離子119.049 2［M＋H－NH3］＋，結合文獻［10］報道，鑒定為腺嘌呤的同分異構體。

峰31、峰39保留時間不同但均產生相同準離子峰，得到二級碎片離子，其中碎片離子m／z136.075 6［M＋H－CO－H2O］＋是通過失去1個CO和1個H2O所得，結合文獻［5－6］報道，分別鑒定為D－酪氨酸、L－酪氨酸。

峰32、峰40的保留時間不同但均得到相同準離子峰及二級碎片離子m／z123.044 1，結合文獻［11］報道，鑒定為2－羥基肉桂酸。

峰37、峰41的保留時間不同但均得到相同準離子峰，并通過失去1個CO和1個H2O得到碎片離子m／z86.096 9［M＋H－CO－H2O］＋，結合文獻［5－6］報道，分別鑒定為D－亮氨酸、L－亮氨酸。

峰48、峰50和峰51的保留時間不同但均產生相同準離子峰及二級碎片離子m／z117.070 0，結合文獻［13］報道，鑒定為萘胺的同分異構體。

2.3.4 負離子模式下鑒定

負離子模式下，峰9、峰21、峰34的保留時間不同但準離子峰相同，通過與檸康酸標準品質譜行為對比，分別鑒定為檸康酸同分異構體。

續表1血藤果藥材中化學成分信息Continued Tab.1 Identification of chemical constituents in the Kadsura Coccinea Fructus

圖1提取離子流圖A.A′.Under the positive ion scanning mode B，B′.Under the negative ion scanning modeFig.1 Extraction ion flow diagram

峰10、峰33的保留時間、碎片信息及特征峰分別與相應標準品一致，故準確鑒定為酒石酸、順式烏頭酸；峰17的準離子峰m／z與二級質譜信息與峰33一致，鑒定為反式烏頭酸。

峰11的保留時間、碎片信息及特征峰與奎寧酸標準品一致，鑒定為奎寧酸；峰22的準離子峰m／z與二級質譜信息與峰11一致，鑒定為奎寧酸的同分異構體。

峰12的保留時間、碎片信息及特征峰與L－（－）－蘋果酸標準品一致，故準確鑒定為L－（－）－蘋果酸；峰23的準離子峰m／z與二級質譜信息與峰12一致，故鑒定為D－（＋）－蘋果酸。

峰20的保留時間、碎片信息及特征峰與檸檬酸標準品一致，準確鑒定為檸檬酸；峰29的準離子峰m／z與二級質譜信息與峰20一致，故鑒定為檸檬酸同分異構體。

峰43、峰44的保留時間不同但得到相同的準離子峰及二級碎片離子m／z147.044 2，72.007 8，結合文獻［5－6］報道，推測其分別為D－苯丙氨酸、L－苯丙氨酸。

3 討論

本試驗中采用UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術，分別在正、負離子掃描模式下首次對血藤果藥材的成分進行研究，共鑒定出絲氨酸、L－精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等氨基酸類成分15個，檸檬酸、酒石酸、奎寧酸、莽草酸等有機酸類成分21個，生物堿、核苷等其他類成分15個。血藤果藥材富含多種營養成分及較高藥用價值，包含多種人體所需氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸為功能性氨基酸［19］，具有預防心血管疾病和調節免疫等作用，精氨酸與組氨酸為兒童生長發育密切相關的半必需氨基酸［20］。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸具有抗菌和抗氧化作用［21－22］。此外，腺嘌呤具有舒張支氣管平滑肌、抑制氣道炎癥、調節免疫作用［23］，尿苷、鳥嘌呤核苷具有抗腫瘤、抗病毒、肝損傷修復等作用［24］。本研究中所建立的方法可高效、快捷地鑒定血藤果藥材中的化學成分，為后續其藥效物質研究奠定了基礎，同時為更全面地開發利用血藤果的藥食兩用產品提供了理論依據。