高效液相色譜法測定鹽酸嗎啉胍片含量及其不確定度評定

朱清麗，李 鵬，郭夢倩，涂蓉榮

（1.陜西省安康市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 安康725000；2.陜西省安康市中心醫院，陜西 安康725000）

鹽酸嗎啉胍片（又名病毒靈）現行標準［1－2］采用紫 外－可見分光光度（UV）法測定鹽酸嗎啉胍的含量。為了進一步提高檢測標準，本研究中參考文獻［3－8］，建立了測定含量的高效液相色譜（HPLC）法。并根據李慎安《化學實驗室測量不確定度》、倪育才《實用測量不確定度評定（第5版）》及參考文獻［9－12］分析新建方法含量測定結果的不確定度，找出了不確定度的主要來源并判定所建方法測定結果的可信度?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2030型高效液相色譜儀（含紫外檢測器、色譜工作站）、UV－2600型紫外分光光度計，均購自日本Shimadzu公司；Milli－Q Integral 5型超純水一體機（德國默克密理博公司）；AUW220D型電子分析天平（精度為十萬分之一）；KQ－250DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸嗎啉胍片（山西太原藥業有限公司，批號為191006，181102；山西津華暉星制藥有限公司，批號為191113）；鹽酸嗎啉胍對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100483－200402，含量100.00%）；甲醇、磷酸二氫鉀均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Phoenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（95∶5，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：237 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 溶液制備

取鹽酸嗎啉胍對照品50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取2 mL，置200 mL容量瓶中，加水定容，制成每1 mL中含10 μg的對照品溶液。取樣品20片，研細，稱取適量，精密稱定（約相當于鹽酸嗎啉胍50mg），置100mL容量瓶中，加水適量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理20 min，加水定容，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容，制成每1 mL中約含10 μg的供試品溶液。取按鹽酸嗎啉胍片處方工藝制備不含鹽酸嗎啉胍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性與系統適用性試驗：分別精密量取2.2項下3種溶液各20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，陰性對照無干擾。分離度均大于1.5，理論板數均大于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.moroxydine hydrochlorideA.Negative reference solution B.Reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

檢測限與定量限考察：取2.1.2項下對照品溶液，逐級定量稀釋后，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以信噪比（S／N）為10∶1時的測得值為定量限，以S／N為3∶1時的測得值為檢測限，結果鹽酸嗎啉胍的定量限為0.017 7 μg／mL，檢測限為0.005 78 μg／mL。

耐用性試驗：取2.1.2項下對照品溶液及供試品溶液，分別在不同流速（0.8，1.0，1.2 mL／min）、不同柱溫（30，35，40℃）、不同色譜柱（Phenomenex C18柱，Agilent C18柱，InertSustain C18柱）下進樣分析（均保持其余色譜參數不變），結果表明，流速、柱溫或色譜柱發生一定程度改變時，本方法能滿足試驗要求，耐用性好。

線性關系考察：精密量取對照品貯備液1，3，5，7，9，10 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻；各精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，定容，制成系列對照品溶液。各精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對質量濃度（X，μg／mL）進行線性回歸，得回歸方程Y＝89 011.0X－447.346，r＝0.999 9（n＝6）。結果表明，鹽酸嗎啉胍質量濃度在2～20 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，重復進樣6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為191006）適量，依法制備供試品溶液，室溫下放置0，2，6，8，12，24 h，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.27%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為191006）粉末適量，按

2.1.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，分別精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果的RSD為0.40%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為191006）粉末適量，平行9份，精密稱定，分別精密加入2.1.2項下對照品貯備液8，10，12 mL，各3份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別精密量取20 μL，并按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n＝9）

2.1.4 樣品含量測定

取各批次樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，各平行4份，分別精密量取20 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算含量。結果平均含量為97.29%，詳見表2。將表2數據與現行標準中的UV法的含量測定結果進行對比，結果批號為191006，181102，191113樣品含量測定結果，UV法均高于HPLC法（99.16%比96.98%，98.86%比96.99%，99.72%比97.89%）。

表2 樣品中鹽酸嗎啉胍含量測定結果（n＝4）Tab.2 Content determination of moroxydine hydrochloride in the samples（n＝4）

2.2 不確定度評定

2.2.1 模型計算方法

2.2.2 主要來源

不確定度的主要來源包括隨機效應與系統效應導致的分量。隨機效應導致的分量有人員的操作分散性，儀器的穩定性、重復性，試樣制備處理及環境等若干隨機效應引入的不確定度。系統效應導致的分量有儀器、玻璃量器的允許誤差，對照品的純度及試驗溫度等由系統效應引入的不確定度。新建方法測量結果的不確定度主要來源有人員操作偏向性，試樣制備處理，儀器測量的穩定性、重復性，天平、玻璃量器最大允許誤差，環境溫度等。

2.2.3 分量計算

1）重復性

把整個檢測過程中隨機效應導致的分量，如人員操作偏向性，試樣制備處理，儀器測量的穩定性、重復性等隨機效應帶來的不確定度分量的分析，以重復性表示。取本實驗室內4名實驗人員按新建方法及測量條件檢測鹽酸嗎啉胍片含量的試驗結果20份，根據測量結果計算其殘差Vk，詳見表3。計算出合并樣本標準偏差Sp。20份樣品的平行試驗結果差值的平均值為：

表3 樣品的測量結果和殘差計算Tab.3 Results of content determination of moroxydine hydrochloride in the samples and calculation of its residual error

按貝賽爾公式計算標準差s（Δk）：

平行試驗2次的平均值q的重復性標準偏差：

自由度：v＝m－1＝19，W＝97.63%。則其相對標準不確定度為

2）對照品溶液校正因子（f）的不確定度分析

（1）對照品取樣量的相對不確定度urel（mR）：稱量所使用的天平為萬分之一及十萬分之一的雙量程電子天平，在d＝0.01 mg檔，檢定證書給出天平示值誤差為0.03 mg，按 矩 形 分 布，0.017 mg，采用減重法稱定質量，則天平校準的標準不確 定 度 為。對 照 品 稱 定 質 量 為10.41 mg，則urel（mR）＝0.024／10.41＝0.002 3。

（2）對照品稀釋體積的相對不確定度urel（VR）：①第1次，試驗中應選用檢定為A級的容量瓶進行定量分析。A級的100 mL容量瓶最大允許誤差為±0.10mL，按矩形分布；本試驗中溫度為23℃，校準溫度為20℃，按矩形分布，則。則②第2次，A級的5 mL單標線移液管最大允許誤差為±0.015 mL，按矩形分布環境溫度變化對玻璃儀器帶來影響，移液管的校準溫度為20℃，本試驗中溫度為23℃，則由此產生的體積變化分散區間半寬a＝5×3×2.1×10－4mL，按矩形分布 ，則u2（VR2）＝0.003 mL。則urel（VR2）＝③第3次，A級的50 mL容量瓶最大允許誤差為±0.05 mL。參照第1次稀釋評定，則

（3）對照品峰面積的不確定度urel（AR）：使用的高效液相色譜儀為自動進樣系統，其進樣體積帶來的不確定度可忽略不計。2份對照品平行進樣2次，峰面積分別為926 563，926 714，942 352，942 766，平均值分別為926 638.5和942 559，采用極差法評定，R分別為151，414，查表，n＝2時，得極差系數C＝1.13，則s（A）分別為133.628和366.372，則

（4）對照品校正因子（f）的合成不確定度：Urel（f）＝3.13×10－3。對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，含量為100%，其帶來的不確定度可忽略不計。天平稱量與稀釋體積測量的重復性，已納入1）重復性評定中，不再進行計算。

3）樣品含量測定的不確定度分析

（1）供試品稱樣量的相對不確定度urel（m）：天平重復性已納入重復性評定中，不再進行計算。采用減重法稱量供試品，根據天平檢定證書的數據，電子天平在d＝0.1 mg檔時天平示值誤差為0.01 mg。按矩形分布，u（m）＝，則天平校準的標準不確定度為。供試品稱樣量為0.0763g＝76.3 mg，則urel（m）＝0.008 1／76.3＝1.06×10－4。

（2）樣品稀釋體積（V）帶入的不確定度：①第1次，同對照品首次稀釋方法評定，urel（V1）＝5.46×10－4。②第2次，2 mL單標線移液管（A級）的最大允許誤差為±0.010 mL，按矩形分布0.005 8 mL。本試驗中溫度為23℃，移液管的校準溫度為20℃，則由此產生的體積變化分散區間半寬a＝2×3×2.1×10－4mL，按矩形分布，則u2（V2）＝0.001 3 mL。則V2的 合 成 標 準 不 確 定 為 ：urel（V2）＝。③第3次，同第1次的稀釋方法評定

（3）供 試 品 峰 面 積 的 相 對 不 確 定 度urel（A）：按2.2.3的2）項的（3）項下方法評定，2份樣品平行進樣2次，峰面積為922 233，921 883，918 553，918 390，則u1（A）＝241.602 2／920 264.75＝2.63×10－4。

2.2.4 不確定度分量

結果見表4。

表4 各種不確定度分量匯總Tab.4 Summary of the weight of various uncertainty

2.2.5 合成不確定度及擴展不確定度計算

合成不確定應根據相對不確定分量合成后求得，

擴展不確定度：取包含因子為k＝2，置信水平為95%，U＝2×0.43%＝0.86%，鹽 酸嗎啉胍片 含量測定結果為W＝（97.0±0.86）%（k＝2）。

3 討論

3.1 檢測方法建立

現行標準采用UV法，為直接測定方式，雖方法簡便，但準確性較低、專屬性不強。HPLC法通過色譜柱進行分離，分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高，可大幅提高檢測的準確度、專屬性。

3.2 檢測波長選擇

預試驗中分別將各溶液在200～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，結果在237 nm波長處均有最大吸收，輔料在237 nm波長處無吸收，故選擇237 nm為測定波長。

3.3 流動相選擇

常用庚烷磺酸鈉溶液－甲醇－乙腈作為類似研究的流動相，考慮到離子對試劑會對色譜柱造成永久性的改性，離子試劑體系重復性不佳，離子對試劑在流動相和色譜柱之間的平衡時間較長等因素，故嘗試用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸二氫鉀流動相系統，結果均不理想。采用本流動相后，檢測到的鹽酸嗎啉胍理論板數均大于5 000，保留時間、分離度、重復性、拖尾因子結果均滿意。流動相比例考察：預試驗中流動相考察了0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（85∶15，90∶10，93∶7，94∶6，V／V），結果兩者比例為85∶15和90∶10時分離結果均不理想，比例為93∶7和94∶6時理論板數及拖尾因子不如比例為95∶5時，故采用0.2 mol／L磷酸二氫鉀溶液－甲醇（95∶5，V／V）作為流動相。

3.4 不確定度評定

HPLC法測定樣品含量不確定度，各影響因素按相對標準不確定度由大到小分別為對照品校正因子、移液管體積、樣品稀釋體積、樣品峰面積、重復性、樣品取樣量。對照品校正因子不確定度中各分量按相對標準不確定度由大到小分別為對照品取樣量、移液管體積、對照品稀釋體積、對照品峰面積，其中主要來源是對照品取樣量較小，在操作過程中應盡量選擇穩定性好、精密度高、天平示值誤差小的天平，同時適當加大對照品取樣量。從移液管體積、稀釋體積分析得出，玻璃量器體積越小，帶來的不確定度越大，故應盡可能選擇體積較大的玻璃量器。在日常工作中要注意對儀器的維護保養、檢定校準及期間核查，使儀器保持良好的工作狀態。加強對檢測人員的培訓，規范試驗操作流程，提高工作能力，減小操作誤差。