高效液相色譜法同時測定馬尾連及硬水黃連提取物中4種生物堿類成分含量

卞艷晶

（山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟寧272025）

馬尾連又名馬尾黃連，出自《本草綱目拾遺》，為毛茛科植物金絲馬尾連、昭通唐松草、貝加爾唐松草、多葉唐松草、高原唐松草等的根及根莖，性寒，味苦，歸心、肝、大腸經，具清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主治濕熱瀉痢、黃疸、瘡瘍腫毒、目赤腫痛、感冒發熱、癌腫［1］263－268。硬水黃連為其近緣藥用植物，又名水黃連、黃腳雞等，為毛茛科植物短梗箭頭唐松草的根或全草。《百草鏡》載：“水黃連，打箭爐出者，形細長，少硬刺，較重于他連，以皮肉帶青色者為佳。出小西天者，色黑有毛者佳，無毛光黃者次之。”其味苦、性寒，歸肝、肺、大腸經，具清熱解毒、利濕退黃、止痢之功效，常用于治療黃疸、痢疾、肺熱咳嗽、鼻疳等［1］274－275。兩種藥用資源均富含多種生物堿及黃酮苷類等成分［2－5］。目前，僅將小檗堿作為馬尾連的指標性成分，硬水黃連則無相關質量研究報道［6－7］。藥理學研究表明，唐松草屬植物中生物堿成分具有顯著抗腫瘤、抗血小板聚集、抗硅肺、抗病毒、抗菌等作用［8－10］。兩者性味、功效相同，但其歸經及其他藥理作用有差異。本研究中提取純化制備馬尾連和硬水黃連提取物，建立了同時測定各提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿及小檗堿含量的高效液相色譜法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀（日本島津制作所株式會社）；RE2000型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TopPette型微量移液器（大龍興創實驗儀器＜北京＞有限公司）；PRM－1012X型超聲清洗機（寧波博爾超聲波設備有限公司，功率為720 W，頻率為25 kHz）；DZF6030型真空干燥機（上海丙林電子科技有限公司）；MS105／A型電子天平（梅特勒－托利多國際貿易＜上海＞有限公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

木蘭花堿對照品（展舒生物科技有限公司，批號為2141095，純度≥99%）；鹽酸藥根堿對照品（批號為110733－201609，純度≥89.5%），鹽酸黃連堿對照品（批號為112026－201802，純度≥94%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713－201814，純度≥86.7%），均購于中國食品藥品檢定研究院；馬尾連提取物（批號分別為20200924，20200930，20201009），硬水黃連提取物（批號分別為20201014，20201020，20201023），均為本實驗室自制；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxEclipseXDB－C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液加0.3%十二烷基硫酸鈉（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min時10%B→23%B，8～20 min時23%B→47%B，20～28 min時47%B～85%B，28～35 min時85%B→95%B）；流速：1 mL／min；檢測波長：268 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

2.2 馬尾連和硬水黃連提取物制備

稱取干燥的馬尾連適量，粉碎，過20目篩，加12倍量純凈水回流提取1次，再加8倍量純凈水回流提取1次，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.3，加乙醇醇沉至醇含量為50%，靜置24 h，離心，取上清液，濃縮至無醇味，采用001×7陽離子樹脂進行吸附，用0.5 mmol／L的氨水溶液進行洗脫，收集氨水洗脫液，濃縮，濃縮液上201×4陰離子樹脂，純凈水洗脫，濃縮純凈水洗脫液，真空干燥，即得馬尾連提取物。硬水黃連提取物制備過程同馬尾連。

2.3 溶液制備

取木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿對照品各適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加適量乙腈溶解并定容，制備得木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質量濃度分別為86.30，227.80，152.60，179.50 mg／L的混合對照品溶液。取馬尾連及硬水黃連提取物各100 mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，用純凈水超聲溶解，加乙腈定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液，即得相應供試品溶液。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：取2.3項下混合對照品溶液、2.2項下馬尾連和硬水黃連提取物供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿4種生物堿類成分的分離度均良好，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.magnoflorine 2.jatrorrhizine 3.coptisine 4.berberineA.Mixed reference solution B.Test solution of Radix et Rhizoma Thalictri extract C.Test solution of Radix Thalictri Brveipis extractFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.3項下混合對照品溶液適量，加乙腈稀釋為含木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質量濃度分別為2.157 5，4.315 0，8.630 0，21.575 0，43.150 0，86.300 0 mg／L，5.695 0，11.390 0，22.780 0，56.950 0，113.900 0，227.800 0 mg／L，3.815 0，7.630 0，15.260 0，38.150 0，76.300 0，152.600 0 mg／L，4.487 5，8.975 0，17.950 0，44.875 0，89.750 0，179.500 0 mg／L的系列對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，以峰面積（A）為縱坐標、對照品溶液質量濃度（C，mg／L）為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 4種生物堿類成分線性關系考察、精密度、穩定性試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation，precision and stability tests of four alkaloids（n＝6）

精密度試驗：精密吸取含木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、檗堿質量濃度分別為8.63，22.78，15.26，17.95 mg／L的混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果見表1，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取馬尾連提取物供試品溶液，室溫下分別于0，2，5，8，12，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果見表1，表明供試品溶液在24 h內穩定。取硬水黃連提取物供試品溶液，同法試驗，結果表明，供試品溶液室溫下在24 h內穩定。

重復性試驗：分別取馬尾連提取物（批號為20200924）和硬水黃連提取物（批號為20201014）100 mg，精密稱定，各6份，按2.3項下方法配制供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算含量。結果見表2。

表2 馬尾連提取物和硬水黃連提取物中4種生物堿類成分重復性試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of the repeatability tests of four alkaloids in the extract of Radix et Rhizoma Thalictri and Radix Thalictri Brveipis（n＝6）

加樣回收試驗：取已知含量的馬尾連提取物（批號為20200924）50 mg，精密稱定，共6份，加適量純凈水，超聲處理使溶解，吸取木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質量濃度分別為43.15，113.90，76.30，89.75 mg／L的混合對照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容。取已知含量的硬水黃連提取物（批號為20201014）50 mg，精密稱定，共6份，加適量純凈水，超聲處理使溶解，加入木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質量濃度分別為21.575，56.950，38.150，44.875 mg／L的混合對照品溶液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容。上述溶液均經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表3。

表3 馬尾連提取物和硬水黃連提取物中4種生物堿類成分加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery tests of four alkaloids in the extract of Radix et Rhizoma Thalictri and Radix Thalictri Brveipis（n＝6）

2.5 樣品含量測定

取3批馬尾連提取物（批號分別為20200924，20200930，20201009）和3批硬水黃連提取物（批號分別為20201014，20201020，20201023）各100 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，計算馬尾連提取物和硬水黃連提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿的含量。結果見表4。

表4 樣品中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿和小檗堿含量測定結果（n＝3）Tab.4 Content determination of magnoflorine，jatrorrhizine，coptisine and berberine in the samples（n＝3）

3 討論

木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿對照品分別經紫外全波長掃描，結果木蘭花堿在271 nm和314 nm波長處有最大吸收，藥根堿在265 nm和345 nm波長處有最大吸收，黃連堿在268 nm和341 nm波長處有最大吸收，小檗堿在264 nm和346 nm波長處有最大吸收，考慮到木蘭花堿在340 nm波長附近無吸收，且在268 nm波長處色譜峰的峰形及基線均良好，故選擇268 nm作為檢測波長。

前期分別考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸溶液、乙腈－0.1%醋酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸加0.2%十二烷基硫酸鈉溶液、乙腈－0.1%磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液等不同流動相體系，結果發現乙腈－0.1%磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液中色譜峰的基線平穩、峰形及分離度均顯著好于其他體系，且色譜圖待測成分保留時間良好。故選擇乙腈－0.1磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉為流動相。

選擇木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿4種生物堿類成分作為考察指標，初步比較了本工藝條件下制備的馬尾連提取物和硬水黃連提取物中成分的含量差異。結果發現，馬尾連提取物中4種成分含量由高至低為藥根堿、小檗堿、黃連堿、木蘭花堿；而硬水黃連中僅檢測到黃連堿和小檗堿，但其中的黃連堿和小檗堿含量均高于同工藝下制備的馬尾連提取物。黃連堿和小檗堿治療肺病（如肺損傷、肺癌、肺炎等）療效顯著［11－14］，可推測硬水黃連中黃連堿和小檗堿的含量高于馬尾連，可能是其歸肺經的原因所在。

綜上所述，所建立的方法簡便快捷，準確度高，重復性和穩定性均較好，可同時測定馬尾連及硬水黃連提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿的含量。由研究結果推測，可能正是這些成分的缺失及含量差異，導致兩者功效及藥理作用不同。后期將進行更深入的分子學研究，以期獲得可靠性結論。