離子色譜法測定那屈肝素鈣注射液中游離硫酸鹽含量

李祥勝，孟雅萍，許雷鳴

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051）

那屈肝素鈣注射液臨床主要用于外科手術中靜脈血栓形成中高度或高度危險的情況［1］，預防靜脈血栓栓塞性疾病，治療已形成的深靜脈血栓，以及聯合阿司匹林用于不穩定型心絞痛和非Q波性心肌梗死急性期的治療。其藥品說明書所載用法還包括血液透析中預防體外循環中的血凝塊形成。那屈肝素鈣是由腸黏膜獲取的氨基葡聚糖（肝素）片段的鈣鹽。肝素雙糖單位中有多個位置被硫酸基團取代，硫酸基取代的位置及數量與肝素的抗凝活性密切相關。當肝素解聚為那屈肝素鈣時，糖鏈上的硫酸基團會脫落，若生產工藝控制不當，硫酸基團會過度解離，從而影響那屈肝素鈣的活性，且那屈肝素鈣注射液的硫酸基團在貯藏過程中也有可能脫落，故應嚴格控制那屈肝素鈣制劑中的游離硫酸鹽。目前（截至筆者投稿時）在國內上市的那屈肝素鈣注射液生產企業有4家，其中國產3家、原研1家（葛蘭素史克），僅原研、國產各1家生產企業以離子色譜法對制劑中游離硫酸鹽加以控制，但這2家生產企業的離子色譜法均存在氫氧化鈉淋洗液濃度偏高導致抑制器電流過大、出峰過早，以及因基線噪音過大影響積分準確性等瑕疵。本研究中參考文獻［2－15］，通過優化色譜條件等對檢測方法進行優化?，F報道如下。

1 儀器與試藥

ICS－5000型離子色譜儀（美國Dionex公司）。硫酸根標準溶液（批號為18094，質量濃度為1 000 μg／mL），草酸鈉標準溶液（批號為19012，濃度為0.1 mol／L），均購自中國計量科學研究院；無水碳酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C10477836，含量為99.0%）；那屈肝素鈣注射液［南京健友生化制藥股份有限公司，批號分別為A40206E，A41105E，A40805E；河北常山生化藥業有限公司，批號分別為F423180403，F42319012，F423190101；天津生物化學制藥有限公司，批號分別為73190201，74190202，74190203；葛蘭素史克＜天津＞有限公司，批號分別為5300（A），5264，5300（B）］；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：IonPacTMAS11－HC柱（250 mm×4 mm）；保護柱：IonPacTMAG11－HC柱（50 mm×4 mm）；柱溫：30℃；電導檢測器，電導池溫度：35℃；抑制器電流：50 mA；淋洗液：3 mmol／L碳酸鈉溶液（等度洗脫）；流速：2.0 mL／min；進樣量：25 μL。

2.2 溶液制備

精密量取硫酸根標準溶液（1 000 μg／mL）適量，用淋洗液稀釋，制成每1 mL分別含硫酸根1，2，5，10，20 μg的系列硫酸根標準溶液。精密量取草酸鈉標準溶液（0.1 mol／L）適量，用淋洗液稀釋，制成每1 mL含草酸根50 μg的溶液，取1 mL與硫酸根標準溶液（10 μg／mL）3 mL，置同一10 mL容量瓶中，加淋洗液定容，搖勻，即得對照品溶液。取樣品0.5 mL，用淋洗液稀釋至50 mL，搖勻，離心，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。以3 mmol／L碳酸鈉溶液（淋洗液）作為空白溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：精密量取2.2項下3種溶液各25 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果分離度為3.5，空白溶液對硫酸根測定無干擾，詳見圖1。

圖1 離子色譜圖1.sulfate ion 2.oxalate ionA.Reference solution B.Blank solution C.Test solutionFig.1 Ion chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2項下系列硫酸根標準溶液各25 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定。記錄色譜圖，以硫酸根質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y＝0.075 04X－0.014 98，r＝0.999 95（n＝5）。結果表明，硫酸根進樣質量濃度在1.0～20.0 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取2.2項下硫酸根對照品溶液（5 μg／mL）適量，倍比稀釋，并按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S／N）為3∶1和10∶1計算檢測限和定量限。結果硫酸根的檢測限為0.03 μg／mL，定量限為0.10 μg／mL。

精密度試驗：精密量取2.2項下硫酸根標準溶液（5 μg／mL）25 μL，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.39 %（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，3，5，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果的RSD為0.58%（n＝7），表明室溫下供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為73190201）適量，按2.2項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果硫酸根平均含量為374 μg／mL，RSD為0.62 %（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（硫酸根含量為374 μg／mL，批號為73190201）0.5 mL，共6份，分別置50 mL容量瓶中，精密加入硫酸根標準溶液（100 μg／mL）0.5 mL，用淋洗液定容，搖勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取12批樣品，分別以天津生化標準方法（方法1）、葛蘭素史克標準方法（方法2）及擬訂方法（方法3）進行測定。結果見表2。

表2 3種方法含量測定結果比較（μg／mL，n＝3）Tab.2 Comparasion of the content of sulfate ion in the samples determined by three methods（μg／mL，n＝3）

3 討論

葛蘭素史克標準方法的測定結果略高于擬訂方法的測定結果（僅1批例外），可能與前者出峰過快（出峰時間為3 min）造成雜質峰不能很好地分離有關；天津生化標準方法的測定結果低于擬訂方法測定結果（僅1批例外），可能與前者基線噪音較大，影響積分的準確性有關。且葛蘭素史克標準方法中色譜柱是少用于離子色譜法的鋼化短柱，氫氧化鈉淋洗液濃度偏高，導致抑制器電流太高，影響其使用壽命，淋洗液配制也相對較煩瑣。本研究中在參考相關文獻的基礎上，通過優化色譜條件來優化檢測方法，新修訂的方法對不同企業那屈肝素鈣注射液中硫酸鹽的含量測定均有良好適用性，且操作簡單，結果準確，靈敏度高，重復性好，可作為國內上市4家企業的那屈肝素鈣注射液中游離硫酸鹽含量的測定方法。