RP-HPLC法測定銀菊感冒膠囊中氨基比林的含量

王 喆 朱正華 張 馨

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

銀菊感冒膠囊是由曲靖市中醫醫院研制的制劑,其主要成分為金銀花、菊花、射干、氨基比林、馬來酸氯苯那敏等，具清熱解毒、解熱鎮痛的功效，用于治療感冒、發燒、頭痛、咽喉腫痛等。氨基比林屬于吡唑酮類解熱鎮痛藥，具有較強的解熱鎮痛效果，藥效緩慢而持久；同時又具有一定的抗炎作用，多用于發熱頭痛、關節痛、神經痛、痛經及活動性風濕癥等；但由于氨基比林能引起骨髓抑制，并可產生亞硝胺致癌物質，因此臨床領域中單用制劑已被淘汰，而現在臨床用藥劑型一般為片劑、注射劑和復方制劑[1]。銀菊感冒膠囊現行質量標準中尚未建立氨基比林的質量控制方法，為更有效控制銀菊感冒膠囊的質量，本實驗以氨基比林為定量控制指標，采用反向高效液相色譜法對氨基比林進行含量測定，并根據《中國藥典》2015年版四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則[2]的要求進行分析方法驗證，以期為銀菊感冒膠囊中氨基比林的質量控制尋找準確可靠且簡便易行的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC40型高效液相色譜儀(配置LC-40DXR系列四元泵，SPD-M40檢測器，CTO-40S柱溫箱，SIL-40XR自動進樣器)；雙頻數控超聲清洗器(KQ-300UDB型，購自昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(METTLE MS205DU，購自上海METTLER TOLEDO)；Millipore超純水機(德國默克集團)。

1.2 試藥 氨基比林對照品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：100503-201803，供含量測定用，含量以99.7%計)；乙腈為色譜純，德國默克公司提供；水為純化水及超純水，由Millipore超純水機制備；銀菊感冒膠囊由曲靖市中醫醫院制劑室提供，批號分別為：200102、200501、200802。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為依利特Hypersil ODS2 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.05 moL/l枸櫞酸溶液(用三乙胺調節pH至3.5)(10∶90，V/V)；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為35 ℃；檢測波長為285 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取銀菊感冒膠囊內容物適量，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入純化水適量，超聲(頻率：45KHz;功率：300 W)30 min，取出，放冷，用純化水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL至50 mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取氨基比林對照品16.12 mg，置25 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為642.87 μg/mL的氨基比林對照品儲備溶液。取儲備液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，即得濃度為160.72 μg/mL的氨基比林對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按銀菊感冒膠囊處方，分別稱取除氨基比林以外的其他原輔料，按照銀菊感冒膠囊制備工藝制作不含氨基比林成分的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取2.2項下的供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液， 按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1(色譜圖中在氨基比林相應出峰位置未出現干擾峰)。

氨基比林對照品(A)

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取濃度為642.87 μg/mL氨基比林對照品儲備溶液適量，加水稀釋制成含氨基比林分別為25.71、80.36、160.72、321.43、642.87 μg/mL 的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以氨基比林對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得回歸方程為Y=5074.69X+8180.22(r=0.9999，n=5)。結果表明：氨基比林濃度在25.71～642.87 μg/mL范圍內與峰面積具有良好線性關系。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取同一氨基比林對照品溶液(濃度為160.72 μg/mL)按2.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，峰面積值的RSD為0.5%，儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號200802)，分別于常溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h后進樣分析，記錄峰面積。結果的RSD為1.1%(n=7)。表明供試品溶液于室溫下放置48 h基本穩定。

2.3.5 重復性試驗 取同一批次銀菊感冒膠囊(批號200802)20粒，混勻，按2.2.1項下的方法，分別精密稱取6份，制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，考察方法的重復性。結果的RSD為0.6%(n=6)。

2.3.6 回收率試驗 分別取已知含量的同一批銀菊感冒膠囊(批號200802)約0.05 g，精密稱定，共6份，分別精密加入對照品約19 mg, 置25 mL容量瓶中，按2.2.1項下的方法處理，制備供試品溶液，分別測定，計算回收率。平均回收率為101.3%，RSD為1.3%。見表1。

表1 回收率測定結果 (n=6)

2.4 樣品含量測定 分別取不同批號的供試品3批按2.2.1項下的方法處理，制備相應的供試品溶液，并根據2.1項下色譜條件依次進樣測定，并記錄峰面積，以外標法計算各供試品中的氨基比林含量。結果見表2。

表2 樣品氨基比林含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 本試驗首先試用文獻[3]中甲醇-水(45：55，V/V)作為流動相測定，結果發現對照品及樣品中氨基比林的峰形拖尾嚴重，后又參考文獻[4-6]對流動相的比例進行調整，結果峰型仍然不太理想，最后試用文獻[7]中的乙腈-0.05moL/l枸櫞酸溶液(三乙胺調節pH至3.5)(10∶90，V/V)作為流動相，結果能得到對稱性較好的氨基比林峰，并且樣品中氨基比林峰與其它雜質峰的分離符合要求，故選用乙腈-0.05mol/l枸櫞酸溶液(三乙胺調節pH至3.5)(10∶90，V/V)為流動相。

3.2 提取方式的選擇 ①提取溶劑的確定：在查詢氨基比林溶解度時發現氨基比林在水和乙醚中溶解[8]，故選用純化水作為提取溶劑；②提取方式的確定：通過查閱文獻[3-5]發現，不同的文獻提取方式各有不同，主要為直接溶解，振搖提取及超聲提取，通過試驗發現超聲提取效果較好，且加標回收率較高，故選用超聲提取。③超聲時間的確定：精密稱取樣品(批號200802)4份,每份約0.1 g，置25 mL量瓶中，加入純化水適量,分別超聲(頻率：45 KHz;功率：300 W)處理10 min、20 min、30 min、40 min后取出，依法操作測定氨基比林含量,結果顯示超聲20 min后, 氨基比林含量基本不再改變，證明樣品超聲處理20 min后，能將樣品中的氨基比林提取完全，所以超聲(頻率：45 KHz;功率：300 W)時間確定為30 min。

本實驗所建立的氨基比林含量測定方法準確、快速、簡便可靠，結果穩定，可用于銀菊感冒膠囊中氨基比林的含量測定。