食管癌癌前病變的臨床分子檢測研究進展

許鎰洧，林逸偉，彭裕輝，李榮耀，李恩民

2018年全球最新癌癥統計數據表明，在全球惡性腫瘤發病率和致死率中，食管癌(esophageal cancer,EC)分別位于第七位和第六位[1]。我國是食管癌高發區，發病率居全球前五[1]，且大部分食管癌患者入院檢查時已處于中晚期，5 a生存率僅30.3%[2]，死亡率居高不下[3]，防治形勢十分嚴峻。

食管癌癌前病變(precancerous lesions,PL)，是指已證實與食管癌發生密切相關的病理變化，食管鱗癌的癌前病變主要指食管鱗狀上皮異型增生，WHO現稱為上皮內瘤變(intraepithelial neoplasia,IN)，其可根據細胞異型增生的程度和上皮累及的深度分為低級別IN (low grade IN，LGIN)和高級別IN(high grade IN，HGIN)。LGIN相當于輕、中度異型增生，異型細胞局限在上皮下1/2以內；HGIN相當于重度異型增生及原位癌，異型細胞累及上皮下1/2及以上。 Barrett食管異型增生則是食管腺癌的癌前病變。Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)是指食管下段的復層鱗狀上皮被化生的單層柱狀上皮所替代的一種病理現象，可伴或不伴腸化生，其中伴有腸化生的屬于食管腺癌的癌前病變，不伴有腸化生的是否屬于癌前病變，目前仍有爭議[4-7]。異型增生與既往使用的術語IN為同義詞,處理原則相同[5]。

目前，臨床上對于食管癌癌前病變的檢測，主要是通過內窺鏡染色技術，同時結合活檢組織病理學探查[8]。迄今，尚沒有特異分子標志物在臨床上應用。但近年來，關于食管癌癌前病變生物標志物的研究日趨增多，主要包括外周血或組織中有關蛋白、自身抗體、基因(或甲基化)和microRNA等，其潛在的診斷意義也越來越受到重視。

1 組織分子標志物

1.1 組織蛋白分子標志物福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded，FFPE)是普遍采用的組織保存方法，可長時間保存組織，反復利用。免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)是目前廣泛應用的一種組織蛋白分子檢測技術，可用于檢測腫瘤組織中某種蛋白的定位/半定量表達，對鑒別腫瘤分子標志物有重要臨床意義。到目前為止，已有多項研究支持檢測組織蛋白表達對于鑒別食管癌癌前病變的臨床指導意義。人抑癌基因P53位于17號染色體短臂，該基因編碼的p53蛋白在細胞增殖的調控中發揮重要的作用。在許多惡性腫瘤中，存在著P53基因的突變和/或缺失，導致p53蛋白半衰期延長并在細胞核中積累[9]。王立東等[10]用IHC檢測方法，在手術切除癌旁組織中的14例正常黏膜、18例基底細胞過度增生、12例IN以及10例原位癌組織標本中，發現p53蛋白異常表達的陽性率分別為0%、78%、92%和80%，而在6例正常黏膜、40例基底細胞過度增生、5例IN的活檢組織標本中分別為50%、97%和100%。這些結果表明在食管癌的病變過程中，p53蛋白在細胞，尤其是細胞核中的積累較早發生，可能是一種識別食管癌高危人群的早期分子標志物。另外，Kaye PV等[11]應用IHC檢測p53蛋白，發現其在食管腺癌癌前病變，尤其是低級別異型增生的診斷中可發揮輔助作用。雖然p53蛋白尚未被批準用于臨床檢測，但有成為診斷食管癌癌前病變分子標志物的潛力。再者，微小染色體維持蛋白2(minichrosome maintenance protein 2，MCM2)屬于MCM蛋白家族，由CDC基因編碼，只存在于處于細胞周期的細胞核中，當細胞進入G0期和分化衰老階段時，MCMs水平下降甚至不能被檢測出來。因此，在增殖發育異常的細胞中，MCM2可作為細胞增殖的分子標記物，提示細胞所處的狀態，且與組織癌前病變程度相關[12]。Sirieix PS等[13]在BE與正常組織樣本的回顧性研究中確定，MCM2蛋白的靈敏度和特異性分別為62.9%和100%，表明MCM2蛋白是BE的潛在分子標志物。還有，三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)為三葉因子多肽家族成員，是一種黏液相關肽，具有多種生物學功能，包括通過細胞遷移進行黏膜修復、調控干細胞分化、與黏液的相互作用、調節黏膜免疫應答等。TFF3與腫瘤的發生發展密切相關，可促進腫瘤的侵襲、轉移與血管生成[14]。Lao SP等[14]利用46例BE組織和99例對照組織樣本檢測TFF3，其中36例BE和6例對照組織樣本顯示TFF3陽性，其靈敏度和特異度分別為78%和94%，提示其可能作為檢測BE的分子標志物。其他潛在的分子標志物，如PFN2、IMP3和COX2等，對于食管癌癌前病變均有良好的診斷效能(表1)，表明檢測相關組織蛋白對于食管癌癌前病變的鑒別診斷有潛在的臨床意義。

表1 食管癌癌前病變相關組織分子標志物[10,13-30]

1.2 組織MicroRNA標志物MicroRNAs(miRNAs)是一類在序列上高度保守的內源性非編碼單鏈小RNA分子，長約19～25個核苷酸，在轉錄后水平發揮調控作用，參與細胞增殖、分化、凋亡等生理病理過程。研究表明，miRNAs是潛在的腫瘤診斷分子標志物，可用于食管癌癌前病變的診斷[31-32]。在一項對BE的研究中，Li XD等不僅證實了檢測病變組織miR-192、miR-194、miR-196a、miR-215擁有潛在的診斷能力(AUC>0.80)，還發現將這些miRNA組合在一起能進一步提高BE診斷的準確性，其敏感性、特異性和AUC分別提高到83.9%～93.1%、90.5%～93.7%和0.87～0.93，顯著提高了診斷效能[25]。

1.3 基因異常甲基化標志物基因甲基化通常發生在DNA分子CpG二核苷酸位點，是哺乳動物基因組的一種表觀遺傳學修飾?；虍惓＜谆?，特別是抑癌基因的異常甲基化，常在食管癌癌前病變階段就已經發生，具有診斷食管癌癌前病變的潛能[33]。在食管癌癌前病變中，HIN-1、P16/CDKN2A和RARβ2等基因的甲基化具有極高的特異性。在Schulmann K等[28]對BE的研究中，也表明了基因的甲基化對于BE檢測有良好的診斷效能，包括APC和3-OST-2等基因。

2 外周血分子標志物

2.1 外周血蛋白分子標志物外周血檢測是一種非侵入性的檢測手段，在癌癥診斷中具有廣泛的應用前景。既往研究發現了多種與腫瘤發生發展相關的外周血蛋白分子標志物[34]。Zhou SL等[35]鑒定了一個自身抗體組合，對于檢測食管癌IN的敏感性為38%，特異性為94%。Zhai Xh等[36]利用185例ESCC和癌前病變組織樣本，通過SELDI-TOF-MS和SVM方法，篩選出了兩組標志物，其中檢測DYS組的標志物組合，包括2944、13768、13978和28061等質譜峰，其敏感性和特異性分別為84.7%和90.6%，而另一組標志物9304、7781和8159等質譜峰，對于檢測食管基底細胞過度增生(basal cell hyperplasia，BCH)的敏感性和特異性分別為59.5%和96.3%。這些研究均顯示了外周血蛋白分子標志物用于檢測食管癌癌前病變的潛力。見表2。

表2 食管癌癌前病變相關外周血分子標志物[35-42]

2.2 外周血miRNA標志物血清miRNA非常穩定，重復性好，可以抵抗RNA酶的消化和苛刻的外部環境，如反復凍融、長時間室溫放置、過酸過堿或極端pH等。外周血miRNA是潛在的非侵入性分子標志物，可用于食管癌癌前病變的診斷[32,43]。Shen Y等通過全基因組miRNA表達譜篩選出7個候選miRNA，在96例ESCC、92例食管癌癌前病變和78例正常食管的組織樣本中進行驗證，發現其中4個miRNA的聯合檢測有良好診斷效能，敏感性和特異性分別為82.6%和80.8%，AUC為0.842[37]。在BE檢測方面，Bus P等的研究也證實了外周血miRNA組合診斷的潛能，其敏感性和特異性分別為78.38%和85.71%，AUC=0.832(95%CI：0.698～0.967)[38]。

3 展望

早診早治既是防治食管癌的重中之重，也是提高患者生存率最為有效的措施。目前臨床上對于食管癌癌前病變的檢測，主要是通過內窺鏡檢查結合染色指示劑活檢及病理學檢查[8]，尚沒有特異生物標志物正式應用到臨床檢測中來。作為理想的生物標志物，不僅應該具有高的敏感性和特異性，還應具有高的陽性預測值和陰性預測值，且能穩定存在于血清或組織中。目前臨床上所用標志物主要有鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等，但由于上述腫瘤標志物大多敏感性或特異性不高，使其在臨床上的應用受到極大的限制，并不能有效地指導食管癌癌前病變的臨床早期診治，因而急需對其他潛在生物標志物進行探索研究并進行性能驗證。近年來，已有許多研究表明，一些分子標志物對于食管癌癌前病變表現出潛在的臨床診斷效能。但總的來說，這些研究仍存在一些問題，例如樣本量小、研究設計單一人群、缺乏獨立驗證試驗、缺乏臨床前數據等。因此，上述相關標志物仍需多中心、大樣本的研究來驗證其診斷效能。