DNA損傷與修復在食管癌中的研究進展

許海軍，阮豪杰，陳 攀，李孟祥，高社干

多種DNA損傷因素能夠引起遺傳物質DNA的損傷，這些因素包括：外部環境中的化學致癌物，機體細胞和腸道微生物代謝所產生的內源性化學致癌物，活化的免疫細胞(如單核細胞和巨噬細胞)產生的自由基，紫外線(ultraviolet,UV)和電離輻射，以及許多藥物等[1-6]。DNA損傷修復不全引起的基因突變和染色體損傷，是癌性轉化和腫瘤進展的重要因素[7]。為了維持基因組的穩定性，細胞具有DNA損傷反應途徑和DNA修復系統，以修復或清除DNA損傷[8]。未能修復的損傷具有細胞毒性，能夠誘導細胞凋亡、壞死[9]，而DNA修復的異常會引起癌癥[10]。DNA損傷引起的細胞死亡是一個主動調控的生物學過程，多種分子參與的復雜分子網絡決定了細胞是生存或死亡[11]。闡明DNA修復與細胞死亡的關系及其分子調控機制，對提高腫瘤化療效果有重大意義。

食管癌(esophageal cancer,EC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，主要包括兩種組織學類型，即：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。ESCC是目前全球最常見的組織學亞型[12-13]。盡管在食管癌的診斷方面取得了進展，但多數患者在發現時已處于晚期，導致整體存活率低。因此，闡明食管癌發生、發展的分子機制，鑒定分子標記物是相當重要的臨床問題。鑒于DNA損傷與修復與食管癌發生發展的密切關系，本文綜述DNA損傷與修復在食管癌發生、發展中的可能作用及其機制，供相關領域研究參考。

1 DNA損傷與修復反應

生物體的遺傳信息儲存于DNA分子的堿基序列中。為應對體內外因素引起的DNA損傷，生物長期進化形成了各種DNA損傷修復機制。在人類基因組的3×109個堿基中，每個細胞每天有高達25 000個堿基通過正常的細胞過程(例如代謝和DNA復制)或在外部因素(例如紫外線)等的作用下被改變。香煙煙霧中的電離輻射、環境致癌物和化學物質等，都可以引起DNA損傷[14]。機體通過修復這些損傷以避免基因突變、染色體斷裂和復制受阻。無法修復的DNA損傷或在修復中出錯，會誘發基因組不穩定和遺傳畸變、癌變，同時也會通過細胞凋亡和遺傳損傷的積累，促進衰老[15]。 因此，對于有機體而言，進行無錯修復以在上述兩個極端之間取得平衡才是最有利的。

細胞內DNA損傷修復的類型取決于DNA損傷的性質。檢測和修復DNA損傷還取決于細胞在細胞周期[16]中的位置，以及損傷區域基因的轉錄活躍程度[17]。此外，DNA甲基化程度和染色質結構也影響DNA修復。如果DNA損傷嚴重，無論細胞處于哪個細胞周期，都會導致細胞周期停滯和凋亡[17]。

由DNA損傷觸發修復機制的調控，引起細胞內的一系列相關反應稱為DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)。DNA損傷的修復途徑有4種類型：對DNA堿基和單鏈斷裂(single-strand break,SSB)氧化損傷的堿基切除修復(base excision repair,BER)、去除大量加合物的核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)、DNA發生錯誤時的錯配修復(mismatch repair,MMR)以及雙鏈斷裂修復(double-strand break repair,DSBR),DSBR又包括兩種機制：非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重組(homologous recombination,HR)，NHEJ直接連接斷端而不需要模板，而HR使用完整的姐妹染色單體作為修復模板，根據細胞類型、環境和DNA損傷的性質，這兩種DSBR修復機制可能會聯合[18-19]。BER、NER、MMR和HR是無錯誤的DDR形式，它們通常產生天然DNA，而NHEJ是一種容易出錯或有缺陷的修復途徑，經常會導致DNA序列改變。

2 DNA損傷與修復相關癌突變信號

2.1 與年齡相關信號

癌基因組中與年齡相關的標志性突變可能在腫瘤生命周期的任何時候發生。在大多數癌癥類型中都能觀察到與年齡相關的突變特征[20]。這種突變過程的特征是CpG二核苷酸基序內的C > T轉變，這種轉變與甲基化胞嘧啶的自發脫氨反應相對應[20]。

2.2 DNA修復途徑缺陷相關信號

失活突變的MMR基因或與HR雙鏈斷裂修復途徑相關的基因，與癌癥的形成和耐藥有關。以CpG位點的C>T轉變為特征的MMR缺陷與核苷酸重復序列上的替代或缺失有關。這些類型的不穩定性，也稱為“微衛星不穩定性”，在結直腸癌、子宮癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、食道癌和胰腺癌中都可以觀察到[20]。

2.3 APOBEC相關信號

載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽(apolioprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide,APOBEC)家族是一類高效的胞苷脫氨酶,其轉錄過程可被促炎癥細胞因子和趨化因子激活,并在人體的固有和獲得性免疫機制中發揮重要作用。APOBEC酶最初被確定為在抗病毒先天免疫中發揮作用，由于其使DNA脫去氨基、誘導堿基轉換的能力，最近被證明參與癌癥的突變負荷和克隆進化[21]。APOBEC酶是將胞苷轉化為尿嘧啶的胞苷脫氨基酶家族的一部分，C到T的轉化和C到G的轉化也是APOBEC酶活性的常見突變結果。APOBEC相關信號是在癌癥中觀察到的第二種最常見的突變信號。

2.4 吸煙相關信號

生活方式因素，如飲食、飲酒、抽煙和缺乏鍛煉，都與癌癥風險增加有關。吸煙是世界范圍內導致癌癥的重要原因，有證據表明，吸煙與20種不同類別的癌癥有關[22]。香煙煙霧可直接誘導不同類型的DNA損傷，這些損傷可通過NER、HR、NHEJ和BER修復。雖然吸煙的特征主要是C>A轉換，這與轉錄偶聯的NER去除大量的DNA加合物有關，但煙草誘導的DNA損傷的多方面性質表明，可能會出現其他與煙草相關的突變類型。

2.5 紫外線相關信號

與紫外線暴露相關的突變特征主要見于黑色素瘤，這種突變特征主要對應于未轉錄DNA鏈上的C >T轉換，與紫外線照射誘導的環丁烷嘧啶二聚體或光產物的修復一致。在整個腫瘤基因組中都檢測到了紫外突變信號，但在黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞皮膚癌中，發現紫外突變信號在轉錄活性啟動子的特定位置富集[23]。導致紫外線介導的啟動子復發性位點突變的機制仍不清楚，還需要進一步研究。

3 食管癌相關的DNA損傷

3.1 ESCC相關的DNA損傷研究

3.1.1 DNA損傷修復與ESCC放射敏感性中國食管癌的主要類型是ESCC，占全球食管癌的70% ，患者5 a生存率不到30%。雖然目前 ESCC的診斷和治療已有改善，但預后仍然很差[24]。在ESCC中BER基因的多態性可能與ESCC的易感性有關[25-26]。NER基因的遺傳變異與ESCC患者的生存結果有關[27-28]。此外，NHEJ途徑中XRCC6和XRCC5基因的遺傳多態性與ESCC的高風險有關[29]。對于維持基因組穩定性很重要的MMR基因MLH1的啟動子甲基化可能是男性ESCC患者預后的預測因子[30]。DNA損傷修復途徑的改變與癌癥的易感性有關，并有助于癌癥的治療反應和耐藥性反應。DDR途徑的紊亂與腫瘤起因、發生發展和療效具有很大關聯，DDR途徑的上調與DNA的放療和化療耐藥性有關[31]。ESCC在DDR通路的基因改變以基因突變和拷貝數變異(copy number variations,CNVs)為主。與其他途徑相比，兩條DNA雙鏈斷裂修復途徑同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)攜帶顯著的基因突變和CNV，尤其是基因擴增。DSB修復基因的激活也是癌癥耐放化療的原因之一[32]。在ESCC中，包括RAD54B、NBS1、RAD51B和 PRKDC在內的大多數基因顯著擴增和過量表達，表明DSB修復途徑在ESCC上調。此外，在DSB途徑基因擴增的ESCC細胞中，分別用于HR和NHEJ的兩種抑制劑mirin和NU7441與電離輻射處理的組合顯著增強了DSBs，降低了克隆形成細胞的存活率，抑制了細胞增殖，并促進了細胞凋亡，這些發現表明，mirin和NU7441可以明顯提高DSB修復途徑基因擴增后的ESCC細胞的放射敏感性，揭示了在ESCC治療中的潛在臨床應用價值[33]。

3.1.2 DNA損傷反應調控，促進ESCC化療敏感性眾所周知，DNA損傷修復是順鉑的重要耐藥機制。HOXB7是HOX家族基因的一員，是重要的發育調節基因，在癌癥中經常發生調節失調。HOXB7在ESCC組織中的過度表達可促進致癌性，并預示著食管鱗癌的不良預后[34]。HOXB7參與了與Ku70/Ku80/DNA-PKC相關的NHEJ修復途徑。然而，NHEJ修復途徑容易出錯，產生有害突變和染色體異常，從而引發腫瘤[35-36]。HOXB7的高表達通過與Ku70、Ku80、DNA-PKcs相互作用并誘導細胞周期停滯而賦予ESCC細胞化學抗性，下調其表達或破壞其功能可增強化學敏感性。HOXB7可作為評價化療耐藥性的生物標志物[37]，是有希望的治療靶點。ATM參與順鉑誘導的DNA損傷反應，并且ATM的激活誘導細胞周期檢查點和DNA修復反應的激活[38]。研究發現E2F1可以通過增強ATM啟動子活性來提高ATM的表達水平。順鉑治療后，通常會激活多種DNA修復機制，對順鉑損傷的DNA進行修復。E2F1-ATM通路中通過miR-302降低ATM表達可導致腫瘤細胞對順鉑等藥物的敏感性增加[39]。ATM缺乏使細胞對順鉑誘導的凋亡敏感。miR-26b通過消除ATM激活參與DNA損傷途徑的調節，最終影響DNA修復和細胞增殖。E2F1增加了順鉑在ESCC的化療敏感性，其作用可能是由于其靶基因miR-26b的上調。miR-26b作為腫瘤抑制基因調節細胞周期停滯，順鉑誘導的周期停滯依賴于ESCC的miR-26b。此外，miR-26b可能通過降低ATM的表達來干擾DNA損傷反應[40]。

3.1.3 DNA損傷修復應答與ESCC耐藥性ESCC患者的預后很差，對ESCC患者進行的化學放射治療(CCRT)經常由于耐藥而失敗。在CCRT反應差的ESCC患者的治療前內鏡活檢中，高DNA甲基化與SOX17的低表達一致。SOX17蛋白表達在區分差的CCRT應答者和好的應答者方面，表現出良好的預測性能。SOX17轉錄下調KYSE510抗輻射細胞中的DNA修復和損傷反應相關基因，包括BRCA1、BRCA2、RAD51、KU80 DNAPK、p21、SIRT1、NFAT5和REV3L，以達到對抗癌治療的致敏作用。在ESCC放射耐藥細胞和異種移植細胞模型中，SOX17的CCRT增敏效應是通過SOX17轉錄調控DNA損傷和修復應答基因實現的。總的來說，通過SOX17介導的轉錄激活腫瘤抑制功能可以作為克服ESCC耐藥的關鍵靶點[41]。

3.2 EAC相關的DNA損傷研究

EAC的獨特危險因素之一是胃食管反流性疾病(gastro-esophageal reflux disease,GERD)，這是一種慢性消化疾病，來自胃的酸性內容物經常與十二指腸膽汁混合，進入食管導致食管組織損傷。在細胞水平上，EAC的進展是由反流和慢性炎癥因子的持續DNA損傷引起的，這些損傷增加了突變率，促進了基因組的不穩定性。反流對食道細胞有遺傳毒性作用，已知的與反流相關的致癌因素是DNA損傷。鹽酸和膽鹽是引起DNA損傷的反流酸的最顯著成分，在體外實驗環境中，短時間暴露于酸性pH值和膽鹽中，可誘發ROS、氧脅迫和DNA損傷[42]。線粒體和NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOX)都被發現與ROS的過量產生有關，反流激活GERD和BE患者食管中的NOX1和NOX2酶[43]。NOX5-S是NOX5的一個階段變種，在酸性條件下也被激活[44-45]，這些酶會產生破壞基因組DNA的超氧陰離子和過氧化氫。ROS也被認為在巴雷特上皮化生(Barrett’s metaplasia,BE)中會導致線粒體DNA突變[46]。

EAC的病因復雜，涉及多種遺傳、飲食、行為和環境因素。胃食管反流已被確認為EAC最強烈的危險因素之一。目前公認的是GERD導致組織損傷和繼發BE，然后發展為食管-咽發育不良和浸潤性癌癥。EAC的發展是由反流引起的DNA持續損傷，促進基因組不穩定和多種腫瘤抑制和致癌途徑的改變。新的和更先進技術的發展有助于更好地了解這種癌癥的分子和細胞基礎，并幫助識別EAC治療的新分子靶點。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)在正常和惡性細胞中起代謝調節劑的作用。EAC中TXNIP的表達與較高的腫瘤分化、淋巴結轉移的缺乏和神經周圍侵襲的減少有關。在食管癌切除術前接受蒽環類化療的EAC患者中，TXNIP高表達也與疾病特異性生存率的提高相關[47]。TXNIP是糖酵解、葡萄糖攝取和糖酵解基因表達的負調節因子，也是多種癌癥的腫瘤抑制因子。葡萄糖和谷氨酰胺對TXNIP的調節，表明糖酵解和OXPHOS在EAC中緊密相連[48]。EAC中的TXNIP明顯低于正常食管。而且TXNIP的過度表達顯著降低了增殖、克隆發生和致瘤性，表明TXNIP在EACC起著腫瘤抑制作用。TXNIP過表達與增加的DNA損傷和細胞凋亡有關，而敲除TXNIP對細胞凋亡有保護作用，TXNIP使EACC對順鉑敏感[49]。

4 展望

DNA損傷修復途徑影響食管癌的治療和耐藥性。目前晚期ESCC的治療以手術加圍手術期放化療為主，但化療耐藥是改善整體生存期的巨大挑戰和障礙，以順鉑為基礎的聯合化療仍是ESCC的重要治療手段。miR-26b可通過降低ATM的表達來干擾DNA損傷反應，E2F1增加了順鉑在ESCC中的化學致敏作用。mirin和NU7441可以通過DSB修復通路基因的擴增顯著提高ESCC細胞的放射敏感性，顯示了在ESCC治療中的潛在臨床應用價值。抑制ROS可以預防GERD誘導的DNA損傷和致瘤性轉化是治療EAC可行策略。 DNA損傷修復的研究，有助于了解食管癌基因突變的機制、治療反應和耐藥性的原因，為食管癌的研究和治療提供新的途徑。