金絲桃素介導的光動力學療法強化CIK對人乳腺癌細胞的抑制作用*

陳小梅，李慧玉，曲濤，高萌，徐向紅

(1.甘肅省人民醫院生物治療中心，蘭州 730000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院干細胞中心，武漢 430022)

乳腺癌是全球女性發病率占據第一位的惡性腫瘤[1]。近年來開發出更有效的治療乳腺癌的療法，如光動力療法(photodynamic therapy，PDT)，它通過光敏劑引發的氧化應激對目標細胞造成損傷，對一些失去手術機會或難治性的腫瘤具有良好療效[2-4]。金絲桃素(Hypericum perforatum L，Hyp)是由金絲桃屬植物分離得到的一種天然光敏劑，易被腫瘤細胞攝取，具有強大的光敏特性、低暗毒性和高單線態氧量子產量[5]，可對多種實體腫瘤實施PDT[5-9]。金絲桃素介導的PDT可誘導腫瘤細胞免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death，ICD)[10-12]，其特點是分泌或暴露損傷相關分子模式(damaged associated molecular patterns，DAMPs)[5-6]。DAMPs是正常情況下存在于細胞內的具有免疫激活作用的分子，在損傷或應激的刺激下，表達在細胞表面或從細胞中釋放出來[13-16]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB-1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和鈣網蛋白(calreticulin，CRT)是3個主要的DAMPs[5-6，12]。雖然PDT并不能有效治療播散性腫瘤[2]，但可提高腫瘤細胞的免疫原性[17]，因此，有必要與其他治療模式結合，如PDT聯合過繼免疫細胞治療[18-19]，后者可治療播散性腫瘤。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)是抗腫瘤過繼免疫細胞治療的首選方案，是將外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子培養誘導獲得的免疫效應細胞，在培養過程中獲得非特異性、自然殺傷類的抗腫瘤細胞毒性[20]。本研究在體外模擬PDT作用，用金絲桃素作為光敏劑誘導MCF7細胞ICD；同時，用所得上清液與CIK細胞共培養以模擬體內DAMPs對免疫細胞的作用，探討Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD對CIK抗腫瘤活性的影響，并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 金絲桃素(大連美侖生物技術有限公司，含量≥98%，批號：S0807AS)；還原型谷胱甘肽(reduced L-glutathione，GSH，德國BioFroxx公司，含量：99.4%，批號：EZ1609A126)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，批號：8072965)；Ficoll淋巴細胞分離液(美國GE公司，批號：10270607)；CIK細胞培養試劑(北京康愛瑞浩生物科技股份有限公司，批號：20191020)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的CD3(FITC-CD3)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的CD8及CD16/56單克隆抗體(PE-CD8、PE-CD16/56)購自美國BD公司(批號：49979)；1640培養基(批號：AE24464298)、胎牛血清(批號：RC35965)均購自美國Hyclone公司；CRT(批號：N21039163)、HMGB-1(批號：D01039219)和HSP70(批號：E25039218)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自武漢華美生物科技有限公司，噻唑藍(MTT，Sigma公司，批號：MKBF7875)。

1.2儀器與設備 LED光源(黃光)購自深圳奇異果光電有限公司，雙通道光功率計型號2936-R(美國NEWPORT公司)，流式細胞儀型號C6PLUS(美國BD公司)，分光光度型號Epoch 2(美國Bio-Rad公司)。

1.3細胞株 人乳腺癌細胞株MCF7購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。

1.4實驗方法

1.4.1流式細胞術檢測Hyp-PDT誘導MCF7細胞凋亡 常規培養靶細胞MCF-7細胞，待細胞長至瓶底的80%，給予消化、懸浮、計數，向6孔板加入細胞，每孔1×106個，待貼壁生長至瓶底的80%，加入不同濃度的金絲桃素：0.15 μmol·L-1、0.20 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1(+0.33 μmol·L-1GSH糾正)，繼續培養2 h，之后分別給予不同光劑量：2.05 J·(cm2)-1、4.05 J·(cm2)-1[5-6]。將未做任何藥物及光照處理的MCF-7細胞作為對照。將Hyp-PDT處理后的細胞繼續培養12 h。收集細胞，洗滌，用100 μL1×Binding buffer重懸細胞(1×106·mL-1)，加Annexin V-FITC 5 μL，室溫下避光反應15 min，上機前5 min再加入碘化丙啶(PI)5 μL。流式檢測各組細胞凋亡率，1 h完成檢測。實驗重復3次。

1.4.3ICD誘導CIK對MCF-7細胞的抑制率 參照文獻[19]方法培養效應細胞CIK細胞。采用淋巴細胞分離液分離健康供者外周血單個核細胞，洗滌2次，用培養液培養，加入滅活的自體血清、γ-干擾素，置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養24 h后，加白細胞介素(IL)-2、CD3mAb，以后每2～3 d適量添加含IL-2、自體血清的新鮮培養基擴增培養CIK細胞。將MCF-7細胞做PDT處理，處理方法同“1.4.2”項。收集上清液，加入24孔板內。將成熟的CIK細胞約2×106個加入含上清液的24孔板內，未做PDT處理的MCF-7培養上清液及同樣數量的CIK細胞加入24孔板內作為對照。24 h后取出所有CIK細胞，洗滌。將對數生長期MCF-7細胞加入96孔板，每孔2×104個，培養12 h貼壁，將ICD誘導后并進行洗滌的CIK細胞加入96孔板內進行殺傷MCF-7實驗，效靶比為20：1。24 h后結束殺傷，用MTT法檢測靶細胞抑制率，酶標儀上讀取波長490 nm處吸光度(A)值，計算各試驗組和對照組的平均A值和抑制率。抑制率(%)=[1-(實驗細胞孔A值-效應細胞孔A值)/靶細胞孔A值]×100%。實驗重復3次。

1.4.4ELISA法檢測Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD后培養上清中的DAMPs分子濃度 MCF7 細胞上清液中DAMPs分子常規培養MCF7細胞，待細胞生長至瓶底80%，給予消化、懸浮、計數，向24孔板每孔加入細胞 1×105個，待貼壁生長至瓶底80%，給予PDT處理，2 h后收集上清液，860×g離心20 min，上清液為待測樣品。按照CRT、HMGB-1、HSP70的ELISA試劑盒說明書操作，將標準品稀釋為要求的倍數，設標準孔8孔建立標準曲線，待測樣品加入檢測孔，將反應板置37 ℃、2 h。棄去孔內液體，不洗滌，每孔加入生物素標記抗體100 μL，將反應板置37 ℃、1 h。棄去孔內液體，用洗滌液將反應板充分洗滌3次，濾紙上印干，每孔加酶標試劑100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃、1 h。用洗滌液將反應板充分洗滌3次，濾紙上印干。每孔加底物溶液90 μL，將反應板置37 ℃、20 min，注意避光。每孔加入50 μL終止液混勻，5 min內用Epoch2分光光度計檢測波長450 nm處A值。使用curve expert軟件繪制標準曲線，標準品濃度為縱坐標，A值為橫坐標，求回歸方程，將樣本A值代入方程計算出各樣品的濃度。

2 結果

2.1流式細胞術檢測Hyp-PDT誘導ICD細胞凋亡 MCF7細胞經Hyp-PDT處理后發生凋亡。流式細胞術檢測早期(Annexin V+/PI-)和晚期(Annexin V+/PI+)凋亡細胞的百分率，數據以百分率表示。各組Hyp-PDT(包括GSH糾正組)誘導MCF7細胞早期凋亡和晚期凋亡的細胞的比例較對照組均明顯上升(P<0.05，FAnnexin V+/PI-=1510.58，FAnnexin V+/PI+=962.42)，且隨著Hyp-PDT的增強凋亡細胞比例顯著上升，而外源性抗氧化劑GSH可以部分阻止Hyp-PDT誘導的ICD，結果見圖1，2。

圖1 MCF7細胞經Hyp-PDT誘導后凋亡情況

①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05。

2.3ICD誘導CIK對MCF-7細胞增殖的抑制 MTT實驗結果見圖4。與對照組比較，除GSH糾正組外，不同強度Hyp-PDT誘導ICD的MCF7細胞上清液誘導的CIK對MCF7細胞增殖的抑制率明顯增高(F=111.49，P<0.05)。不同光劑量聯合不同質量濃度Hyp誘導MCF7細胞ICD的上清液誘導CIK對MCF7細胞增殖的抑制率不同，抑制率隨Hyp-PDT劑量的增加而升高。各Hyp-PDT組相互比較結果顯示，0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組這3組間差異無統計學意義(P>0.05)。以上結果表明，Hyp-PDT誘導ICD的MCF7細胞上清液能增強CIK細胞的抗腫瘤活性。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與正常對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與E，F，G組比較，均P<0.05；④與F，G組比較，均P<0.05；⑤與F，G組比較，均P<0.05；⑥與G組比較，P<0.05。

2.4免疫原性死亡MCF7細胞上清液中HMGB-1、HSP70和CRT含量 ELISA實驗結果見圖5。與對照組比較，除GSH糾正組外，不同強度Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD的上清液中測得CRT、HMGB-1和HSP70濃度顯著升高(P<0.05，FCRT=389.70，FHMGB-1=2907.96，FHSP70=1897.32)，提示DAMPs是基于Hyp-PDT誘導的ICD增強CIK殺傷活性的關鍵因素。

A.正常對照組；B.GSH糾正組；C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組；F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組；①與對照組比較，P<0.05；②與GSH糾正組比較，P<0.05；③與其他Hyp-PDT組比較，均P<0.05

3 討論

腫瘤轉移是乳腺癌治療效果不佳和死亡的主要原因[21]。目前，乳腺癌的治療主要以外科手術和藥物為主[22]，但外科手術和化療藥物會帶來嚴重的副作用。因此，尋找安全有效、毒副作用低的治療方法顯得尤為重要。Hyp-PDT已被證實是在技術上可行的腫瘤治療的新方法[7-9，23]，Hyp-PDT治療通過直接的細胞毒性作用、血管損傷和誘導免疫應答殺死腫瘤[12]，尤其是對一些失去手術機會或難治性的腫瘤，均具有良好療效且毒副作用小。本研究中，筆者將人乳腺癌MCF7細胞作為Hyp-PDT誘導乳腺癌細胞ICD的模型。為明確Hyp-PDT過程對MCF7細胞的損傷程度，分析細胞凋亡，結果顯示Hyp-PDT組細胞凋亡比例均高于對照組和GSH糾正組，證明Hyp-PDT可引起乳腺癌細胞ICD。在此基礎上進一步分析Hyp-PDT對MCF7細胞的損傷可知，凋亡細胞的比例隨著Hyp-PDT劑量的增加而顯著升高，而GSH可糾正0.25 μmol·L-1Hyp和4.05 J·(cm2)-1光劑量組引起的MCF7細胞ICD。這一結果與ZHENG等[5]研究報道一致，說明Hyp-PDT能夠激活MCF7細胞氧化應激反應并誘導ICD，而GSH能減輕氧化應激對MCF7細胞的損傷。

在Hyp-PDT中，一些關鍵DAMPs的暴露或釋放對ICD至關重要[17]。通過對Hyp-PDT誘導MCF7細胞ICD后的培養上清液中DAMPs的分析發現，Hyp-PDT組上清液中CRT、HMGB1、HSP70含量顯著高于對照組和GSH糾正組；隨著Hyp-PDT劑量的增加，ICD細胞上清液中DAMPs分子濃度亦升高，因此DAMPs可能是Hyp-PDT強化CIK殺傷腫瘤細胞活性的關鍵因素。由此可推測，經歷ICD的腫瘤細胞通過DAMPs的釋放增加腫瘤細胞的免疫原性，改善免疫抑制微環境，破壞免疫逃逸平衡，增強淋巴細胞的抗腫瘤活性。本研究結果初步支持ICD相關的DAMPs在增強CIK殺傷效能方面的關鍵作用，當然并不排除其他分子的作用。需要說明的是，本研究只針對一種特定的癌癥類型和一種細胞系。即使在同一種癌癥中，癌癥本身也是異質性的，因此很難推斷這種治療方法對所有癌癥都有效。

綜上所述，本研究證明將Hyp-PDT與CIK治療聯合應用具有協同抗腫瘤作用，基于Hyp-PDT的ICD在CIK抗腫瘤免疫應答過程中具有重要作用，DAMPs是提高免疫應答關鍵分子，這為PDT和免疫細胞治療的結合提供了體外試驗證據，為播散性腫瘤的治療提供了新的方法和思路。