膽芩溫敏眼用凝膠的基質處方優化及其體外釋放性能*

郭俊國，郭新苗，王剛，宋繼科，畢宏生2，，田景振

(1.山東中醫藥大學藥學院，濟南 250355；2.山東中醫藥大學眼科研究所藥學室，濟南 250002；3.山東中醫藥大學管理學院，濟南 250355；4.山東中醫藥大學附屬眼科醫院實驗中心，濟南 250002)

葡萄膜炎為眼科難治性致盲性眼病，且該病多發于青壯年，社會危害極大，治療主要采用糖皮質激素或免疫抑制劑，易導致青光眼、向心性肥胖等眼部和全身并發癥，對患者造成二次傷害，且除糖皮質激素或免疫抑制劑外，目前國內外尚無改善患者癥狀的其他治療藥物[1]。葡萄膜炎中醫學屬瞳神緊小、瞳神干缺等范疇，大量臨床實踐表明，中醫治療葡萄膜炎優勢明顯，可提高臨床療效，降低復發率，提高患者視覺質量，但臨床缺乏安全有效的中藥制劑[2-3]。前期研究發現不同濃度黃芩苷可明顯抑制大鼠白細胞介素17(IL-17)、γ干擾素(IFN-γ)水平，梔子苷和膽酸對IL-17、IFN-γ抑制作用呈濃度依賴性[4-5]。此外，實驗發現冰片對黃芩苷、梔子苷在離體和在體角膜均具有明顯的促滲透作用，可增加有效成分的角膜通透率及生物利用度，且冰片具有良好的耐受性[6]。在大量基礎研究的基礎上，課題組根據葡萄膜炎中醫病機，在前期研究的基礎上，優化精簡處方，研制中藥組分配伍臨床協定方——膽芩方，已獲授權發明專利2項[7-8]。

膽芩方中膽酸清熱解毒，為君藥；黃芩提取物黃芩苷清熱瀉火解毒，加強膽酸清熱解毒之功，為臣藥；梔子苷清熱涼血，瀉火解毒，加強清熱明目之功，為佐藥；冰片可通諸竅，促進藥物吸收，為佐使藥。全方諸藥相合，點眼外用，可直達病所，共奏清火、解毒、明目之功。臨床發現膽芩方“目浴法”治療葡萄膜炎可顯著提高治愈率和有效率，降低復發率和激素積分，不僅可減輕眼部炎癥反應，且無激素樣毒副作用，療效顯著。此外研究發現，膽芩眼用凝膠中冰片可增加梔子苷前房內藥物濃度，無刺激性，可減輕葡萄膜炎大鼠的前房炎癥反應，具有較好的治療作用[9]。

滴眼劑是眼部最常用劑型，但其流失嚴重、生物利用度低，如何提高生物利用度是制劑研究的關鍵[10]。原位凝膠以溶液狀態給藥，給藥后形成凝膠狀態或半固體狀，有助于延長藥物滯留時間，成為研究熱點溫度敏感型凝膠與黏膜具有良好生物相容性，外觀清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，適宜外用治療[12]。溫度敏感型凝膠在生理溫度下吸熱發生膠凝，形成透明、柔軟、潤滑的凝膠，且制備工藝相對簡單、使用便利，在淚液的沖刷下緩慢溶解后排出體外，避免眼膏黏附、滴眼劑滯留時間短等弊端[13]。因此，本研究將膽芩方制為凝膠，并考察體外溶蝕性和釋藥性，為葡萄膜炎治療提供一種創新藥物，有助于提升眼用中藥新藥創制水平。

1 儀器與試藥

1.1儀器 U-3000液相色譜儀(DAD檢測器，美國賽默飛公司)，MS205DU電子天平(德國梅特勒托利多公司，感量：0.01 mg)，EL204電子天平(德國梅特勒托利多公司，感量：0.1 mg)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SIM-F140AY65-PC制冰機(松下電器產業株式會社)，78-1型磁力攪拌器(常州博遠實驗分析儀器廠)，CRYOBASICIS滲透壓分析儀(意大利ASTORI公司)，PHS-3CW酸度計(上海般特儀器有限公司)，RC-6溶出度測定儀(天津天光光學儀器有限公司)，SHZ-82A恒溫振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，GMP中試車間(沈陽興齊眼藥股份有限公司)。

1.2試藥 黃芩苷和梔子苷提取物(陜西森弗生物技術有限公司，含量≥95.0%，批號：HQG090417和ZZG090625)，天然冰片(濟南建聯中藥店，批號：100078-200414)，黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201016)，梔子苷對照品(中國食品檢定研究院，批號：110749-200714)，泊洛沙姆407(P407，美國Sigma公司，批號：62035)，泊洛沙姆188(P188，美國Sigma公司，批號：P4894)，丙二醇(PGI)(天津科密歐化學試劑有限公司，批號：20190516)，色譜乙腈和甲醇(Tedia of United States America)，其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1溫敏凝膠的制備 采用冷溶法制備膽芩溫敏眼用凝膠。稱取膽酸5.0 g、黃芩苷提取物3.0 g、梔子苷提取物2.0 g，加入注射用水250 mL，攪拌下加入40%氫氧化鈉溶液3 mL使其完全溶解(pH值9.0±0.5)，緩慢加入P188(pH值8.5±0.5)后，取P407，加入注射用水620 mL，室溫溶脹24 h。另稱取冰片1.0 g加入PGI溶液，研磨溶解完全。將上述溶液加入到溶脹液中，加水至1000 g，孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，灌裝。

2.2相變溫度的測定

2.2.1凝膠相變溫度測定 采用傾斜法測定相變溫度[14]。具體為：取凝膠樣品5 mL，置10 mL西林瓶，蓋上中間打孔的橡膠塞，插入溫度計(精度0.1 ℃)，并保證溫度計感應端浸入溶液。水浴中平衡20 min，按照0.5 ℃·min-1緩慢升高溫度，每間隔20 s傾斜西林瓶60°，記錄溶液凝固時的溫度即為相變溫度(Tgel)，平行測定3次。

2.2.2淚液稀釋后凝膠相變溫度的測定 參考文獻[15]，精密稱取氯化鈉(NaCl)6.78 g、氯化鉀(KCl)1.38 g、碳酸氫鈉(NaHCO2)2.18 g、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.084 g，加水配制成人工模擬淚液1 L。取凝膠樣品5 mL，加入人工模擬淚液(40：7)875 μL，按上述“2.2.1”方法測定人工淚液稀釋后的相變溫度(Tatd gel)，平行測定3次。

2.3凝膠基質單因素考察

2.3.1P407對相變溫度的影響 固定P188(3%)和PGI(10%)濃度，設置7個P407濃度，分別為17%、19%、21%、23%、25%、27%及29%。按上述“2.1”方法制備眼用凝膠，測定其Tgel和Tatd gel。結果發現P407濃度增加，Tgel和Tatd gel逐漸下降，Tgel擬合方程為Y=-2.408X+36.77(R2=0.982)；Tatd gel擬合方程為Y=-2.058X+45.87(R2=0.948)。當P407濃度>23%時，Tatd gel低于35 ℃，選擇23%，25%和27%作為-1，0和+1水平進行星點設計。

2.3.2P188對相變溫度的影響 固定P407(25%)和PGI(10%)濃度，設置5個P188濃度，分別為1%，3%，5%，7%及9%。按 “2.1”項方法制備眼用凝膠，測定其Tgel和Tatd gel。結果發現P188濃度增加，Tgel和Tatd gel升高，Tgel擬合方程為Y=1.0286X+21.600(R2=0.907 6)；Tatd gel擬合方程為Y=1.9657X+27.52(R2=0.962 7)。當P188濃度<5%時，室溫(25 ℃)條件下為液體，Tatd gel低于35℃，選擇3%、5%和7%作為-1、0和+1水平進行星點設計。

2.3.3PGI對溫度的影響 固定P407(25%)和P188(3%)，設置5個PGI濃度，分別為2%，6%，10%，14%及18%。按“2.1”項方法制備眼用凝膠，測定其Tgel和Tatd gel。結果發現低濃度PGI，可增加Tgel和Tatd gel，PGI濃度>6%相變溫度下降，但溫度變化幅度不明顯。由于PGI可作為保濕劑、促滲劑和增溶劑，且對溫敏眼用凝膠的相變溫度存在雙向影響，選擇4%，6%和8%作為-1，0和+1水平進行星點設計。

2.4星點設計-效應面法優化處方

2.4.1實驗設計 基于單因素研究結果，確定P407(X1)、P188(X2)和PGI(X3)質量分數為考察因素，各因素設5個水平，代碼為±α(1.682)、±1和0，以Tgel和Tatd gel為響應值，利用Design Expert軟件進行3因素5水平星點設計-效應面法(CCD-RSM)設計實驗，見表1，實驗安排及結果見表2。

表1 各因素水平的代碼值及實際處方量

表2 DQTOG基質優選的星點設計安排

表3 多種模型方差分析表

表4 方差分析結果

2.4.3效應面預測分析與處方優化 根據二項式方程繪制Tgel和Tatd gel效應指標與考察因素的等高線圖及三維效應面圖，見圖1和圖2。結果表明固定P407濃度，P188濃度增大，Tgel值先降低后增高；PGI濃度增大，Tgel值逐漸升高。固定P188濃度，P407濃度增大，Tgel值增加到24.6 ℃后不再增加；PGI濃度增大，Tgel值逐漸升高。固定P407濃度，P188濃度增大，Tatd gel值先降低再增高；PGI濃度增大，Tatd gel值逐漸升高。固定P188濃度，P407濃度增大，Tatd gel值降低；PGI濃度增大，Tatd gel值先降低再增高。

理想眼用凝膠約25 ℃應為液體，當滴入結膜囊內約34 ℃迅速形成凝膠，根據圖1和圖2，Design Expert軟件給出最優基質處方：P407濃度為24.5%，P188濃度為6%，PGI濃度為6%，預測Tgel值為24.7 ℃，Tatd gel值為34.4 ℃。

圖1 各因素對Tgel的等高線圖及三維效應面圖

圖2 各因素對Tatd gel的等高線圖及三維效應面圖

2.4.4凝膠基質處方驗證 按照優選基質配比，GMP中試車間進行3批產品驗證，測定Tgel和Tatd gel值，實驗實際值與模型預測值比較接近，結果見表5。Tgel的RSD值為2.30%，Tatd gel的RSD值為0.81%，偏差絕對值均<3%，說明該模型可較好地預測各因素和凝膠相變溫度的關系。

表5 優選基質處方驗證結果

2.5含量測定方法 色譜條件與系統適用性實驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇為流動相A，0.1%甲酸為流動相B，梯度洗脫：0 min，88.0% B；0～3 min，88.0%B；>3～20 min，88.0%→60.0% B；>20～21 min，60.0%→88.0%B；>21～25 min，88.0% B；檢測波長：0～10 min為240 nm；>10～25 min為276 nm。理論板數不低于6000。

對照品溶液制備：精密稱定黃芩苷、梔子苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含黃芩苷0.3 mg、梔子苷0.2 mg的混合溶液，即得。

供試品溶液制備：精密稱定樣品1 g，加甲醇稀釋至10 mL，濾過，取上清液，即得。

測定法：分別精密吸取對照品和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.6體外溶蝕動力學考察 在4 ℃條件將2 g自制DQTOG加入平底試管中，35 ℃恒溫恒濕箱預熱30 min，液面平整狀態下形成凝膠。加入預熱釋放介質(人工模擬淚液)2 mL，35 ℃固定頻率，振蕩30 min，倒出釋放介質，并用濾紙吸干，迅速稱量，再次加入預熱釋放介質2 mL，重復上述操作[16]。結果發現固定90 Hz震蕩頻率，累積溶蝕量隨截面面積增加而增大，見圖3；固定1.76 cm2截面面積，累積溶蝕量隨震蕩頻率的增加而增大，震蕩頻率為150 Hz時，在120 min累積溶蝕量已達1.87 g，而震蕩頻率為0 Hz時，在180 min累積溶蝕量僅為0.33 g，見圖4。表明制備的DQTOG溶蝕量與截面面積和震蕩頻率密切相關。

圖3 截面面積對體外溶蝕量的影響

圖4 震蕩頻率對體外溶蝕量的影響

2.7體外釋藥性考察 采用第二槳法考察體外釋藥性[17]。稱取2.0 g制備的DQTOG于西林瓶中，35 ℃恒溫恒濕箱預熱30 min，將西林瓶置于溶出杯底部，加入人工模擬淚液500 mL，35 ℃，定時取樣量10 mL，孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，高效液相色譜(HPLC)測定含量。結果發現DQTOG在300 min基本能夠釋藥完全，不同轉速對梔子苷和黃芩苷的釋藥曲線略有差異，轉速越快，釋藥時間越短，轉速為75 r·min-1時，黃芩苷和梔子苷在90 min內釋放速度較快，累積釋放率分別為(55.12±4.01)%和(45.67±3.19)%。結果見圖5和圖6。結果表明制備的凝膠具有良好的緩釋作用。將黃芩苷和梔子苷累積釋藥量與時間進行零級、一級、Higuchi 模型擬合，見表6。結果顯示黃芩苷的體外釋放符合一級方程，梔子苷的體外釋放符合零級方程。

圖5 轉速對黃芩苷體外釋放曲線的影響

圖6 轉速對梔子苷體外釋放曲線的影響

表6 黃芩苷和梔子苷外釋放擬合方程

3 討論

原位凝膠給藥后形成凝膠狀態或半固體狀，有助于延長藥物滯留時間，根據相變機制分為溫度敏感型、離子敏感型和 pH 敏感型原位凝膠，其中溫度敏感型凝膠與黏膜具有良好生物相容性，外觀清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，適宜眼部治療。目前溫敏凝膠基質主要有N-異丙基丙烯酰胺、泊洛沙姆、殼聚糖等聚合物，由于N-異丙基丙烯酰胺結構中存在酰氨基和異丙基，其凝膠質地較硬，會與角膜產生摩擦，眼科較少應用，泊洛沙姆為類聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具有較好的生物相容性，是一種理想的藥用輔料，可用于口服、局部給藥和注射等，殼聚糖化學活性較強，生物黏膜黏性強，在眼睛局部可產生輕微的刺激性，因此本研究選取泊洛沙姆進行研究[18]。本研究采用傾斜法測定Tgel和Tatd gel，可避免攪拌子法攪拌速率和攪拌子大小影響測量結果，結果發現當P407濃度<20%時，其Tgel值>30 ℃，Tatd gel值>40 ℃，難以形成凝膠，這是因為低濃度的P407溶液中聚氧丙烯的比例相對較低，P407具有溫度敏感性質，較低黏度難以形成凝膠。在P407溶液中加入水溶性較好的P188，可增加聚氧丙烯相對含量，當P188>3%時，在35 ℃即可形成凝膠。另外本研究發現，PGI濃度<6%時，可增加凝膠的相變溫度，但當PGI濃度>6%時其相變溫度成下降趨勢，由于丙二醇具有良好的互溶性、保濕性等，在溫敏眼用凝膠的制備中加入一定比例的PGI可增加凝膠制劑的穩定性、保濕性和潤滑作用。通過3個單因素考察研究，確定P407、P188和PGI的3個水平進行星點設計。

眼用凝膠在角膜表面的鋪展狀態會在很大程度上影響到藥物的釋放速率，而鋪展狀態受到眨眼剪切作用的影響，因此考察釋放面積對凝膠溶蝕和藥物釋放的影響，應用振蕩頻率來模擬眨眼的頻率。本研究通過體外溶蝕動力學發現，固定震蕩頻率累積溶蝕量隨截面面積增加而增大，固定截面面積，累積溶蝕量隨震蕩頻率的增加而增大，表明制備的DQTOG溶蝕量與截面面積和震蕩頻率密切相關。溫敏眼用凝膠劑在非生理狀態下為液體，在結膜囊內受到溫度的影響而發生溶膠-凝膠相變，轉變為黏稠凝膠，顯著延長藥物與角膜的滯留時間，提高生物利用度體。淚液分泌和眨眼反射會使眼瞼不斷混合凝膠與淚液造成凝膠溶蝕，藥物釋放入淚液，人工淚液在振蕩條件下凝膠表面產生類似眨眼的剪切作用，因此采用類似研究片劑或經皮給藥凝膠藥物釋放行為的方法，模擬眼用凝膠在體內過程[17]。外釋藥性考察發現DQTOG中黃芩苷和梔子苷的釋放規律不同，黃芩苷的體外釋放符合一級方程，梔子苷的體外釋放符合零級方程，初步說明該凝膠中的有效成分可以持續、穩定地從體系中釋放出來，具有一定的緩釋作用。