家兔股骨植入可降解型鎂合金加壓螺釘?shù)纳镄c抗菌性能研究

王照華，楊 越，徐景超，張雁儒

（河南理工大學醫(yī)學院1，骨科研究所2，河南 焦作 454000）

鎂合金是因骨折而進行的骨修復中常見的骨支架材料。骨支架對骨折的康復發(fā)揮協(xié)同作用，而最理想的支架材料應能在術后初期發(fā)揮其機械特性，起到固定支撐骨組織的作用，待骨組織愈合后可逐漸自行降解和消失[1]。骨支架材料一般分為生物降解型和非生物降解型，傳統(tǒng)的非生物降解型的骨支架僅能支持骨組織，維持其形態(tài)。其優(yōu)點在于耐磨損、韌性高、穩(wěn)定性強。但存在需要二次手術取出的情況，增加了患者痛苦與經(jīng)濟負擔。目前，降解型材料是主要的生物材料發(fā)展方向，鎂合金作為一種新型生物植入材料，與人體有較高的生物相容性，且容易降解[2]。鎂離子是人體必需的常量元素[3]，但其也有韌性較差、降解過快等風險性。目前對鎂合金生物材料的研究大多傾向于降解過程、生物安全性、生物力學等方向，而對其于骨生長的影響與抗菌性能研究較少[4]。可吸收性鎂合金植入物在生物體內的應用效果與抗菌性能仍需探究。故本研究以家兔為研究對象設計實驗，植入新型可降解鎂合金螺釘，觀察其降解效果與抗菌性能，探究其生物安全性以及對骨生長的影響，旨在為新型可降解鎂合金植入物在臨床方面的選擇與應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康白色成年新西蘭家兔20只，雌雄不拘，體質量4.1～4.8 kg，體溫38.5 ℃～39.5 ℃，由河南理工大學醫(yī)學院實驗動物房提供。飼育室室溫（20±3）℃，相對濕度50%～60%，晝夜光照節(jié)律12 h∶12 h，兔糧食用量為400～500 g/d，自由飲食水。對實驗動物的處理與實驗目的符合人類的道德倫理標準和國際慣例，符合3R 規(guī)則。細菌菌株：感染動物所用細菌由河南理工大學病原生物實驗室提供的金黃色葡萄球菌菌液（S.aureus）（1×1011/L）。新型可降解鎂合金螺釘：植入體內的兔用新型可降解鎂合金螺釘由焦作市新港醫(yī)療設備有限公司提供，主要材料：Mg3Zn1Ag。病理切片相關儀器與試劑：BQ-318D 石蠟切片機（湖北伯納醫(yī)療科技有限公司）、HS-1145病理組織漂烘儀（金華市華速科技有限公司）、Bx53熒光倒置顯微鏡[奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司]、組織包埋盒、冰醋酸、甲醛、二甲苯、石蠟、乙醇（50%、75%、95%、無水乙醇）、水楊酸脫鈣液（鹽酸8 ml，醋酸5 ml 和水楊酸10 g）。手術器械及藥品：兔盒、兔用解剖臺、常用手術器械、克氏針、骨鉆、生理鹽水、10%水合氯醛、碘伏。金黃色葡萄球菌檢測：常用菌種接種器械、梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鎂合金加壓螺釘?shù)闹踩?將健康成年家兔隨機分為對照組與實驗組，各10 只。于術前禁食3 d，捉拿稱重后經(jīng)兔盒固定后用10%水合氯醛溶液以2 ml/kg 的劑量，經(jīng)耳緣靜脈處注射進行麻醉處理。待其角膜反射與疼痛反射消失后對手術部位進行脫毛處理，俯臥位固定于消毒后的兔用解剖臺。術者洗手穿戴手術服，對手術部位及周圍用碘伏擦拭消毒，加蓋手術鋪巾并用布巾鉗固定。在體表可捫及大轉子處沿股骨向下方處做一長約2 cm 切口。用手術刀切開皮層與肌肉層直至股骨，組織鉗固定皮層并擴開創(chuàng)口后，用止血鉗游離周圍肌肉。完全暴露出骨干，經(jīng)生理鹽水沖洗后用克氏針選擇骨干粗壯處鉆孔定位，再經(jīng)骨鉆擴孔后向骨髓腔內注射金黃色葡萄球菌液0.5 ml（1×1011/L）并加壓擰入鎂合金螺釘。沖洗并縫合創(chuàng)口。待清醒后術側活動無障礙、精神狀態(tài)良好、進食正常即為手術成功，見圖1。對照組實驗家兔行相同手術處理，不植入加壓螺釘。術后家兔實施單籠飼養(yǎng)，正常術后護理[5]。

圖1 鎂合金加壓螺釘?shù)闹踩胧中g

1.2.2 鎂合金螺釘?shù)挠跋駥W檢測 分別于術后30、60 d 對術側進行X 射線影像學觀察。

1.2.3 骨組織切片觀察 術后60 d，實驗家兔空氣栓塞法處死。解剖取其完整股骨，剔除肌肉組織觀察。之后用咬骨鉗截取需要部位。放入固定液中固定后再經(jīng)水楊酸脫鈣液脫鈣處理-除酸-梯度乙醇脫水-二甲苯透明-石蠟—二甲苯混合液浸透-液態(tài)石蠟浸透的步驟，即可進行包埋切片[6]。選取完整的切片進行漂片與攤片，將玻片烘片處理后經(jīng)逆梯度乙醇置水，再經(jīng)蒸餾水沖洗后以此進行蘇木素染色-沖洗-伊紅染色-沖洗-梯度酒精脫水-二甲苯透明的步驟，最后滴加中性樹脂封片，制作成功后后使用倒置顯微鏡進行觀察[7]。

1.2.4 金黃色葡萄球菌檢測 處死后于無菌環(huán)境下取手術部位周圍分泌物及部分組織，進行細菌培養(yǎng)，經(jīng)藥敏分析系統(tǒng)鑒定金黃色葡萄球菌是否存在。

1.3 觀察指標 ①影像學：觀察螺釘是否固定良好，周圍有無骨壞死，螺釘在植入期間有無緩慢降解；②股骨大體解剖觀察：周圍肌肉組織與骨髓腔是否出現(xiàn)炎癥，螺釘是否降解完全，有無膨大骨痂；③組織切片觀察：有無成骨細胞、壞死骨細胞，骨細胞排列形態(tài)，骨小梁形態(tài)；④金黃色葡萄球菌檢測：兩組分別取手術部位分泌物及組織培養(yǎng)后進行金黃色葡萄球菌檢測，比較兩組陰性率。

2 結果

2.1 影像學檢測結果 術后30、60 d 的影像學檢測結果發(fā)現(xiàn)，30 d 時可見螺釘已出現(xiàn)腐蝕，X 光片可見其螺紋模糊、螺釘直徑變小，但固定良好。且周圍骨組織無病變、壞死、塌陷等不良反應。60 d 時已不可見螺釘，但可觀察到創(chuàng)口愈合后的骨痂。且周圍骨組織無病變無壞死，未有骨質疏松樣癥狀，見圖2。

圖2 術后X 光攝像

2.2 股骨形態(tài)、HE 切片結果 實驗家兔活動正常，未見術側異常、萎縮等癥狀。離體股骨經(jīng)肉眼觀察可見原植入螺釘處螺釘已完全降解。原螺釘植入處的骨組織增生，傷口愈合并形成膨大的骨痂，周圍肌肉組織無炎癥反應見圖3；組織切片觀察：對膨大的骨痂部位包埋切片后行HE 染色處理，于顯微鏡下放大40 倍可見骨細胞與成骨細胞迅速增長，細胞至無序排列，見圖4。與對照組相比，成骨細胞較多，且細胞排列更具有無序性，缺少細胞的有序性與致密性，植入物被成骨細胞填充，無壞死骨細胞，見圖5。

圖3 術后股骨形態(tài)

圖4 植入螺釘處經(jīng)HE 染色骨切片顯微觀察

圖5 對照組骨切片經(jīng)HE 染色

2.3 細菌種類鑒定 實驗組金黃色葡萄球菌陰性率為90.00%。對照組金黃色葡萄球菌陰性率為20.00%，證明鎂合金螺釘具有一定的抗菌效應。

表1 金黃色葡萄球菌檢測結果

3 討論

目前大量的實驗研究已經(jīng)證明鎂合金植入物生物兼容性強、降解完全，是較為安全的生物材料[8]，而在目前的骨科植入物的研究中，醫(yī)用金屬材料仍被廣泛用于骨折固定。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)金屬材料存在不銹鋼中的鎳離子可導致機體出現(xiàn)過敏性皮炎等癥狀的不足，鈷合金中的鈷鎳元素具有致敏性，鈦合金中的釩攝入體內會導致機體血壓的變化等[9]。一些固定材料需二次手術取出，增加患者痛苦。故鎂合金作為生物材料受到廣大研究人員的關注。但鎂合金材料公認的缺點在于韌性較差，降解速度過快，降解不完全[10]。本實驗家兔進行的日常活動中未出現(xiàn)術側異常、萎縮等不良反應。影像學觀察發(fā)現(xiàn)，螺釘逐漸降解，周圍骨組織未有骨質疏松樣癥狀。證明新型可降解鎂合螺釘降解速度合理，降解完全。表明其相較于傳統(tǒng)加有抗菌涂層的鈦合金植入物相比，具有更加優(yōu)良的生物安全性，且避免二次手術[11]。

本次實驗觀察實驗組家兔股骨組織切片發(fā)現(xiàn)：植入鎂合金螺釘?shù)牟课怀晒羌毎黾樱墙M織排列無序，相對于對照組骨細胞生長速度較快，證明其對骨生長與骨愈合具有一定的促進作用。有學者表明其原因在于鎂離子是人體含量第2 位的陽離子，且半數(shù)以上的陽離子存在于骨組織中，其缺失可導致血鈣降低，易導致骨質疏松，鎂離子對于內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持也起到重要作用[12]。既往研究顯示，骨組織中富鎂環(huán)境下可刺激骨生成、提高細胞黏附率、抑制破骨細胞等作用。鎂離子能夠通過多個信號通路影響骨代謝，促進新骨的形成從而刺激骨折愈合。鎂離子促骨生長機制與抗菌機制相協(xié)同，促進手術部位骨組織的愈合且有效降低了術后骨髓炎等潛在風險，表明其更適宜作為髓內植入物所使用。

王湛等[13]經(jīng)體內植入鎂合金材料實驗探究發(fā)現(xiàn)，對于新型鎂合金材料植入物在植入體內對于革蘭陰性菌——大腸桿菌、革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌作用。而在體外實驗中也具有較好的抗菌性能。本實驗中金黃色葡萄球菌菌種檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組金黃色葡萄球菌陰性率為90.00%，且髓腔內無骨髓炎并發(fā)，而對照組金黃色葡萄球菌陰性率為20.00%，表明新型可降解型鎂合金材料具有一定的抗菌性。其機制可能在于鎂降解產生的OH-表現(xiàn)為堿性，導致局部pH 的增高，而細菌的最佳生長pH 為7.4～7.6[14]。從pH 的方向抑制了細菌的生長，達到了抗菌的作用有關。另有學者認為鎂離子的抑菌性能在于細菌胞膜外高濃度的金屬陽離子破壞了原內外離子濃度差，形成新的內外濃度差，從而阻礙一些細胞生長物質的轉運。并且金屬離子可能存在有使細胞內酶失活的作用，從而影響細胞的正常生化反應[15]，但具體原因尚不明確。

綜上所述，新型可降解型鎂合金材料在家兔體內具有較高的生物安全性，排異反應小的同時又具備了優(yōu)良的抗菌性能，有效抑制金黃色葡萄球菌，減少了骨髓炎、術后感染等潛在風險。但目前對于鎂合金材料抗菌性能的臨床研究仍較少，仍有待于對鎂合金植入物的非細胞毒性與鎂離子的具體生化反應進行研究，并評估其臨床上的生物效應。