ACACB 啟動(dòng)子甲基化和蛋白表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌中的臨床意義

徐艷瓊，唐 銘，楊承綱

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，云南 昆明 650100；2.云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650034）

甲狀腺癌（thyroid cancer）是一種增殖率最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率不斷升高[1，2]。由濾泡細(xì)胞產(chǎn)生的分化型甲狀腺癌（DTC）進(jìn)一步細(xì)分為乳頭狀甲狀腺癌（PTC）、濾泡性甲狀腺癌（FTC）和許特爾細(xì)胞癌（HTC），其中PTC 是最常見(jiàn)的組織學(xué)類型[3]。DNA 甲基化是惡性腫瘤常見(jiàn)的表觀遺傳修飾，抑癌基因的甲基化可以影響基因的表達(dá)水平，從而有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對(duì)腫瘤甲基化的檢測(cè)，有助于制定腫瘤的治療方案以及預(yù)后評(píng)估[4]。近年來(lái)研究顯示，多個(gè)基因與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Khatami F 等[5]報(bào)道CDH1 和SCL5A8 基因與甲狀腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；謝小紅等[6]發(fā)現(xiàn)PCDH8 基因甲基化與乳頭狀甲狀腺的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB）是乙酰輔酶A 的一種亞型蛋白，能阻礙脂肪酸的β 氧化過(guò)程，在脂質(zhì)代謝中起重要作用的基因[7]。在腫瘤細(xì)胞中，95%的脂肪酸是從頭合成的，會(huì)有脂肪酸的積累，積累到一定程度時(shí)會(huì)形成乳腺腫瘤組織的膜脂質(zhì)，影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響機(jī)體的生命活動(dòng)[8]。對(duì)ACACB 進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其在喉部鱗狀細(xì)胞癌、三陰性乳腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黑色素瘤中低表達(dá)。有研究報(bào)道對(duì)調(diào)控PTC 進(jìn)程的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與脂肪代謝密切相關(guān)的ACACB 表達(dá)量顯著下調(diào)，并被預(yù)測(cè)為是與PTC 患者預(yù)后相關(guān)的基因[9]。ACACB 在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)水平降低可能與其甲基化有關(guān)[10]。本研究通過(guò)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行研究，旨在檢測(cè)ACACB 在甲狀腺乳頭狀癌患者中的甲基化和蛋白表達(dá)水平，探討其作為預(yù)后和生存指標(biāo)的可能性，為臨床精準(zhǔn)治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 于2020 年11 月-2021 年3 月在云南省第一人民醫(yī)院采集10 例乳頭狀甲狀腺癌患者的腫瘤組織和癌旁正常組織樣本，所有組織采集后保存在-80 ℃冰箱，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 主要試劑 ACACB 多克隆抗體（貨號(hào)：PA5-52309；品牌：Thermo Fisher）和TaqManTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑（貨號(hào)：N8 080234；品牌：Thermo Fisher）購(gòu)買自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP304-02；品牌：TIANGEN）購(gòu)買自云南表達(dá)科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號(hào)：ab 270054；品牌：abcam）購(gòu)買自昆明貝爾吉科技有限公司；引物合成自昆明擎科生物科技有限公司。

1.3 ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取癌和癌旁組織基因組總DNA，甲基化特異性PCR（MSP）上游引物MF1：AATTTTGAAGAGAATGTGGTAAT 和下游引物：MR1：TTTAAAAAACAAACCCCCATTAAA；甲基化非特異性 PCR（USP）上游引物：UF1：TGGGTTGGGTATTGTGTAGGTA 和下游引物UR1：AACCCTCAAATCACACCAC。甲基化檢測(cè)PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，后續(xù)30 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s），循環(huán)結(jié)束，72 ℃延伸2 min，最后4 ℃保持。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）提取乳頭狀患者癌細(xì)胞中的RNA，使用TaqManTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄成CDNA 后，使用上游引物ACACB F1：AAAGAAACACGGGCTTGAGTTGG 和下游引物 ACACBR1：TGATCTTTAGGCACCTGTGTGCT 進(jìn) 行q RT-PCR。β-actin 最為內(nèi)參，其上游引物序列：5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游引物序列：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。PCR 程序ACACB：95 ℃預(yù)變性3 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s、60 ℃退火25 s、72 ℃延伸30 s）72 ℃延伸5 min。β-actin：95 ℃預(yù)變性3 min，28 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min，隨后4 ℃保持。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析（WB）提取乳頭狀甲狀腺癌和癌旁組織總蛋白質(zhì)，定量變性后，進(jìn)行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行脫脂牛奶孵育2 h，孵育結(jié)束后PBST 洗膜3 次，每次5 min，按照1∶1000 稀釋ACACB 抗體，過(guò)夜孵育后進(jìn)行顯影檢測(cè)，每組進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 使用軟件Image J 計(jì)算WB 圖片每個(gè)條帶的灰度值，隨后將各組灰度值輸入軟件Graph－Pad Prism 8 進(jìn)行柱狀圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 ACACB 基因mRNA 表達(dá)量分析 與癌旁正常組織相比，乳頭狀甲狀腺癌組織中ACACB 基因mRNA 水平均下調(diào)，且不同乳頭狀甲狀腺癌樣本中ACACB 水平下調(diào)水平差異較大，2、5、31 和28 號(hào)樣本中乳頭狀甲狀腺癌組織和癌旁正常組織的ACACB基因mRNA 表達(dá)水平差異最大；25、26 和27 號(hào)樣本中乳頭狀甲狀腺癌組織和癌旁正常組織的ACACB基因mRNA 表達(dá)水平差異最小，見(jiàn)圖1。

圖1 乳頭狀甲狀腺癌組織和癌旁正常組織中ACACB 基因mRNA 表達(dá)量比較

2.2 ACACB 蛋白在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)WB 檢測(cè)顯示，8 例患者的ACACB 基因蛋白水平低于癌旁正常組織，僅2 例患者（2 號(hào)和3 號(hào)樣本）ACACB 基因的蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常組織，ACACB 的表達(dá)量與乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，見(jiàn)圖2。

圖2 ACACB 蛋白在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)

2.3 ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化水平 甲基化特異性PCR 檢測(cè)顯示，在乳頭狀甲狀腺癌組中ACACB 基因發(fā)生啟動(dòng)子甲基化的比率為60.00%（6/10），正常樣本中ACACB 基因發(fā)生啟動(dòng)子甲基化的比率為30.00%（3/10）；另外有20.00%（2/10）的甲狀腺癌組織和癌旁正常組織同時(shí)發(fā)生甲基化，見(jiàn)圖3。

圖3 ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化水平

3 討論

多個(gè)報(bào)道顯示，在乳頭狀甲狀腺癌中，癌組織中ACACB 基因mRNA 表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織[11，12]，但其對(duì)于乳頭狀甲狀腺癌的調(diào)控機(jī)制以及ACACB 基于表達(dá)異常的機(jī)制尚不清楚。本研究顯示，不同來(lái)源樣本的乳頭狀甲狀腺組織中，癌組織和癌旁正常組織中ACACB 基因的mRNA 表達(dá)水平存在不同程度的差異。但WB 結(jié)果顯示，8 例乳頭狀甲狀腺癌組織的ACACB 基因蛋白水平低于對(duì)應(yīng)癌旁組織，僅2 例乳頭狀甲狀腺癌組織中ACACB 基因蛋白存在高表達(dá)；與此同時(shí)，60.00%的乳頭狀甲狀腺癌組織存在啟動(dòng)子甲基化。因此，在乳頭狀甲狀腺癌中ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化會(huì)降低ACACB基因轉(zhuǎn)錄。

Li X 等[10]研究認(rèn)為，乳頭狀甲狀腺癌中ACACB基因mRNA 水平下降可能與其甲基化水平相關(guān)。本研究中，存在ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化的癌組織中ACACB 基因的mRNA 水平均降低，25、26 和27號(hào)樣本癌組織存在較低甲基化水平，同時(shí)其癌組織中ACACB 基因mRNA 水平與癌旁組織相差最小。

本研究不足之處：本次通過(guò)對(duì)乳頭狀甲狀腺癌組織中ACACB 基因的表達(dá)水平及甲基化水平的研究，發(fā)現(xiàn)ACACB 基因表達(dá)異常與其甲基化水平相關(guān)，但ACACB 基因表達(dá)異常與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍不明確。與此同時(shí)，在少數(shù)樣本中ACACB基因蛋白水平有一定程度上升，其原因尚不清楚，后續(xù)仍需在細(xì)胞層面對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究。

綜上所述，乳頭狀甲狀腺癌中存在較高比例的ACACB 基因啟動(dòng)子甲基化，啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生影響了基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)其蛋白水平相應(yīng)下降，但具體機(jī)制尚不清楚。