補腎解毒通絡方阻止白血病復發機制的網絡藥理學分析

孫維龍，許鑫欣，陶霞，施偉鵬，竺佳，范晨陽，李帝萱，楊向東

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

臨床中化療是成人急性白血病（AL）治療的主要選擇，但預后通常不容樂觀［1-2］。急性髓細胞性白血病（AML）和急性淋巴細胞白血病（ALL）的長期緩解率水平很低，尤其ALL 的長期緩解率僅為30%～40%，化療后復發仍是困擾AL 治療的重要問題［3-4］。在骨髓中，對造血干細胞（HSC）的增殖、分化、存活和歸巢起支持作用的最小解剖結構是骨髓微環境（即龕）。這個微環境由骨細胞、血管周細胞、骨內膜細胞、脂肪細胞、巨噬細胞以及間充質干細胞等共同構成［5］。其中，間充質干細胞（MSC）與HSC 的關系尤為密切，它可以通過物理支持和分泌可溶性因子來調控HSC 的維持和分化，是龕中的關鍵元素［6］。在白血病進程中，白血病干細胞（LSC）會通過“劫持”作用將龕改造為適合LSC 生長并改變HSC 功能的環境［7］。不同的細胞因子利用多種途徑實現了這種作用，并由此介導了LSC的動員、歸巢和耐藥性，最終成為臨床復發的重要原因［8］。針對被“劫持”龕的治療，可能為治療白血病復發提供新的研究方向［9］。

現代中醫藥作為中國傳統醫學的發展和延伸，是我國臨床醫學的重要組成部分。癌癥的臨床治療中，中醫藥憑借增效減毒、預防復發、延長生存時間等多方面的優勢，發揮著獨特的補充作用［10］。其中，補腎解毒通絡方對于延長復發難治白血病患者生存周期的效果顯著［11］。在前期研究中，筆者證明了補腎解毒通絡方（BSJDTLF）對輻射后小鼠的MSC 具有修復作用，并能在MSC 與K562 細胞的共培養中下調白血病相關基因［12］。這為研究BSJDTLF 的藥理機制提供了實驗基礎。

隨著實驗技術與信息技術的發展，中醫藥的研究已經從傳統的“單一藥物”“單一靶點”過渡到“多組分”“多靶點”的網絡藥理學研究模式。網絡藥理學在中藥靶點預測、生物活性化合物篩選、毒性評價、機制研究等方面發揮了巨大的作用，為中醫藥復方的研究提供了新的策略［13-14］。同時，基于高通量測序技術的發展，蛋白組學、基因組學也越來越多參與疾病研究，尤其是腫瘤的研究中［15-16］。其中蛋白組學可以實現對細胞和組織內復雜的蛋白質進行全面的定性和定量分析，較為全面的覆蓋不同樣本中蛋白質的變化關系［17］。因此，高通量蛋白組學可以從側面驗證網絡藥理學的篩選成果。在本研究中，筆者首先基于質譜分析明確BSJDTLF 的化合物成分，再通過網絡藥理學與蛋白質組學相結合的方法，研究BSJDTLF 與白血病之間的關系，并對其作用機制、靶點進行預測。具體研究流程見圖1。

圖1 研究分析的流程圖

1 材料和方法

1.1 BSJDTLF中化合物的鑒定

1.1.1 BSJDTLF的藥物組成

組方：全蝎10 g，僵蠶10 g，鹿角片15 g，龜甲15 g，白附子10 g，人參10 g，枸杞子10 g，滑石10 g，青黛5 g，甘草5 g。藥物來源于天津中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。

1.1.2 BSJDTLF的樣品制備

取復方藥粉10 g加100 mL水煎煮30 min，煎煮后約得50 mL提取液，在旋轉蒸發儀45 ℃水浴上濃縮至一定體積后的復方濃縮液，將濃縮液放入培養皿中，在-80 ℃冰箱預冷凍后，放入凍干機至過夜凍干，取出凍干后的樣品密封保存待用。精確稱取10.00 mg 樣品至離心管中，加入1 mL 超純水溶解，離心（14 000 rpm/min，20 min，4 ℃），取上清液100 μL至進樣小瓶中，以超純水作為空白溶劑，進樣。

1.1.3 質譜條件

質譜分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS（QExative）系統下完成，離子源為高能電噴霧離子源（HESI 源），掃描模式為Full-ms/ dd-ms2，正負離子模式下同時采集。源參數：源噴霧電壓（spray voltage）正離子為3.5 kV，負離子為2.8 kV，毛細管溫度（capillary temperature）320 ℃，離子源加熱溫度（probe heater temperature）350 ℃，鞘氣（sheath gas，N2）為35，輔助氣（auxiliary gas，N2）為10，S-lens 水平為50 V，碰撞能量為20、40、60 V，掃描范圍為m/z 100～1 500，分辨率為70 000。

1.1.4 質譜儀器

超高效液相色譜質譜聯用儀UHPLC-/ESI-QOrbitrap MS（美國Thermo Fisher Scientific）；3K15 型高速離心機（美國Sigma 公司）；KQ-250E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AX 205 型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；BP121S 型萬分之一天平（德國Sartorius 公司）；XW-80A 型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；日本東京理化EYELA 旋轉蒸發儀DPE-2150（山東愛博科技貿易有限公司）。

1.1.5 數據處理與分析

將采集到的原始數據利用Xcalibur（4.2，Thermo-Fisher Scientific）軟件進行數據記錄、分析及處理，化合物的鑒定是基于文獻基礎，根據化合物的質荷比、二級碎片進行。

1.2 化合物相關靶點的收集

質譜結果中化合物的相關靶點是在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）與CTD（http：//ctdbase.org/）兩個數據庫檢索得到的。檢索結果通過Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫統一為基因名稱。并對統一名稱后的靶點與化合物對應關系進行了合并，并刪除了重復項。

1.3 已知白血病相關靶點的收集

通過“leukemia”為關鍵詞在NCBI（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/gene/）于GENE CARD（https：//www.genecards. org/）兩個數據庫中進行了搜索，去除了搜索結果中的重復基因，整合了兩個數據庫共有的2 864個靶點。

1.4 蛋白質組學

實驗中的蛋白質組學測定是委托天津舍維斯生物技術有限公司進行（項目編號：QLSWS003-20190614001），采用了由ABSCIEX公司研發的iTRAQ技術。

1.5 GO、KEGG和關鍵子網絡的分析

首先使用STRING（https：//string-db.org/）數據庫進行了PPI 分析，并得到了相關靶點的功能和通路富集。隨后，將PPI 關系導入Cytoscape 3.7.1 中進行了網絡圖的繪制，使用MCODE 插件對其核心子網絡進行篩選。

1.6 實驗動物

7 周 齡 的 雄 性BALB/c 小 鼠，SPF 級，體 質 量（22±2）g，北京華阜康科技股份有限公司，許可證編號SCXK-20190008。飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物中心SPF級屏障內，給予常規飲食，定期更換墊料。

1.7 分組及給藥方法

采用隨機分組法分為給藥組與對照組（n=6），給藥組給予BSJDTLF（以10 g/50 mL 的濃度制作水煎劑）灌胃，每天1 次，每次0.2 mL。對照組給予生理鹽水（NS）灌胃每天1 次，每次0.2 mL。4 周后統一處死小鼠，并提取MSC。

1.8 小鼠MSC的提取和培養

在無菌條件下從小鼠骨髓中提取髓內細胞，使用針對小鼠MSC 的選擇培養液MesenCult 套裝（STEMCELL CAT#05513）配合貼壁法對MSC 進行純化培養。所用MSC均遵照以上方法進行了3次傳代。

2 結果

2.1 BSJDTLF中化合物的鑒定

BSJDTLF 的水溶液10 g/50 mL，經過濃縮、凍干制取上機樣本。隨后使用超高效液相色譜質譜聯用儀對樣本進行檢測。將采集到的原始數據利用Xcalibur（4.2，Thermo-Fisher Scientific）軟件進行數據記錄、分析及處理。其中化合物的鑒定是基于文獻的基礎，根據化合物的質荷比、二級碎片進行的。通過準確的分子離子質量及二級碎片進行分析，數據精度誤差閾值在5 ppm以內，共鑒定出182個化合物，鑒定結果見圖2。

圖2 正、負離子模式下的水提物總離子流圖

2.2 BSJDTLF中化合物的靶點

使用TCMSP與CTD數據庫［18］，在數據庫中檢索與質譜結果中182個化合物相關的靶點，將這些靶點結果通過Uniprot及DAVID數據庫統一為基因名稱。去除重復項后，共得到與其中100種化合物相關的1 969個靶點。

2.3 BSJDTLF與白血病相關靶點的篩選

以“leukemia”為關鍵字，分別在NCBI GENE 與GENE CARD 數據庫中檢索，其中，在NCBI 中檢索到29 693 個結果，在GENE CARD 檢索到15 655 個結果。為了增強疾病與基因的相關性，筆者對兩個數據庫的檢索結果進行了交集比對，再去除重復項后，共得到了2 864個共有靶點作為白血病相關靶點使用。隨后，將在TCMSP與CTD數據庫得到的BSJDTLF中化合物相關基因（1 969個）與2 864個白血病相關靶點進行比對，共篩選到了623個靶點。這些靶點可能揭示BSJDTLF 作用于白血病、延緩復發的具體機制。見圖3。

圖3 BSJDTLF中化合物1 969個靶點與NCBI和GENE CARD中白血病相關基因的交集

2.4 BSJDTLF給藥小鼠MSC的蛋白質組學分析

通過質譜與數據庫分析篩選到了623 個BSJDTLF作用于白血病的可能靶點。但是這種基于已有實驗的數據庫分析可能存在偏差，為了進一步驗證BSJDTLF對于MSC 的作用關系，本研究采用iTRAQ（isobaric tagsf or relative and absolute quantitation）技 術 對BSJDTLF 灌胃小鼠及NS 灌胃小鼠的MSC 進行了蛋白質組學分析，以明確其產生差異的靶點。iTRAQ 是一種相對和絕對定量的高通量分析方法，目前被廣泛的運用到癌癥，尤其是白血病的研究中［19-20］。

將未經處理的7 周齡BALB/c 小鼠隨機分為兩組（n=6），分別給予BSJDTLF 和NS灌胃（0.2 mL/d）。給藥28 d 后，處死小鼠并提取骨髓細胞，使用選擇培養液，通過貼壁法對小鼠的MSC 進行了選擇性擴增。在得到滿足蛋白質組學實驗所需數量的細胞后，使用iTRAQ 技術將兩組樣本進行了高通量蛋白質組學測定。對兩組的蛋白質組學數據進行比對后，共得到了728 個差異蛋白（差異性＞1.2）。這些差異蛋白為進一步分析BSJDTLF 作用于白血病的潛在靶點提供了實驗證據。

2.5 BSJDTLF潛在靶點的分析

將數據庫中BSJDTLF 與白血病相關的623 個靶點同蛋白組學產生差異的728 個蛋白進行了比對、分析。再去除重復結果后，共得到了50 個共表達的基因（見圖4）。這50 個共表達基因可能成為揭示BSJDTLF 作用途徑的潛在靶點。在篩選出補腎解毒的潛在靶點后，通過STRING 對這些靶點進行了PPI 與功能、通路的富集分析，隨后使用Cytoscape 對個網絡進行了優化。見圖5。

圖4 數據庫、疾病相關基因、蛋白質組學的結果進行交集比對圖

圖5 50個潛在靶點的PPI網絡圖

通過Cytoscape，同時也構建出了這50個潛在靶點與BSJDTLF 中化合物的關系，這些靶點共與29種化合物相對應。見圖6。

圖6 潛在靶點與相關化合物的網絡圖

此外，本研究還使用STRING 對潛在靶點進行了GO 條目下功能注釋的富集分析。從細胞組分（cellular component，CC）、分 子 功 能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）三個部分描繪了潛在靶點的功能富集（見圖7）。在這三個方面本研究著重于BP 部分的功能富集，其中在“strength”值排名前15 的條目中包含了腫瘤壞死因子產生、調控 及 自噬細 胞 相關（GO：0032640、GO：1903265、GO：0048102）。見表1。

表1 功能富集中與生物過程有關的排名前15的條目

圖7 潛在靶點的功能富集分析圖

在KEGG通路富集分析中，選取了排名前15的通路，錯誤發生率（false discovery rate）均＜0.01。通路中包含了與慢性白血病（mmu05220）、凋亡（mmu04215）、急性白血病（mmu05221）、VEGF（mmu04370）相關的通路。見表2。

表2 通路富集中排名前15的KEGG通路

2.6 潛在靶點K-Core核的分析

選取Cytoscape3.7.1 中的MCODE 插件對50 個潛在靶點進行K-Core 分析。K-Core 是一種分解相互作用的網絡關系的拓撲分析，可以在復雜的網絡關系結構中尋找到重要的節點［21］。在置信度＞15，KCore為2的條件下，篩選出了潛在靶點PPI網絡中的核心子網絡（見圖8）。這個核心子網絡中，包含了10 個靶點：Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela。通過中心性計算，Icam1、Alb、Rela 三個靶點的中介中心性最高。這個核心子網絡中的節點，尤其是Icam1、Alb、Rela 及相關基因可能是BSJDTLF的作用靶點。

圖8 50個潛在靶點的K-Core

3 討論

在本研究中，首先通過液相色譜質譜分析BSJDTLF 中的化學成分，共發現182 種化合物。在TCMSP 和CTD 中將這些化合物的靶點進行檢索，得到了與之相關的1 969個靶點。將1 969個靶點與白血病相關靶點和蛋白質組學的差異蛋白進行了比對，篩選出50 個潛在靶點。最后，對這些潛在靶點進行了功能富集、通路富集、PPI和K-Core方面的數據分析。

在功能富集分析中，首先著重于BP 部分的內容。此部分排名前15 的條目中，發現了與腫瘤壞死因子（TNF）相關的富集（GO：0032640、GO：1903265）。TNF被證明與白血病的關系密切，它參與白血病發生的所有步驟，包括細胞轉化、增殖、血管生成和髓外浸潤［22］。尤其在白血病干細胞（LSC）對骨髓微環境的改造中，TNF 與其他因子共同誘導了MSC 的改變［23］。抑制TNF-1α 的表達可以增強化療對白血病干細胞的作用，減少耐藥性，因此TNF 可以作為白血病治療的靶點［24］。在中醫藥的有關研究中，有證據表明人參皂苷可以對白血病細胞的TNF 產生影響，從而抑制LSC 的增殖［25］。

在KEGG 分析中，除去慢性白血病（mmu05220）、急性白血病（mmu05221）的相關通路，VEGF 信號通路（mmu04370）也應引起重視。在非腫瘤化的龕中，VEGF 參與介導MSC 的增殖與分化，對機體的功能修復起到正向作用［26-27］。然而在被白細胞作用的微環境中，VEGF 產生了異常的上調［28］。這種上調介導的血管重塑構建了針對HSC 的“陷阱”，使得MSC 對HSC 的支持作用減弱，同時又保護了LSC 免于化療殺傷［29］。而對于VEGF 的靶向治療大多數基于已有藥物的聯合用藥［30-31］。這些藥物雖然可以抑制白血病中VEGF 的分泌，延長了患者的生存時間［32］。但是，針對VEGF 的靶向藥物或減緩聯合用藥副作用的研究仍有很大的空間［32］。

在PPI分析中，使用K-Core對潛在靶點互作網絡的核心子網絡進行了篩選，這個子網絡共包含了10 個節 點：Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela。其中，Icam1、Rela 是兩個中介中心節點。Icam1（即CD54），可被IL-1 和TNF 誘導，并被巨噬細胞、淋巴細胞和基質細胞表達［33-34］。在白血病中，Icam1 也被證實與白血病細胞對龕的改造相關，白血病細胞會分泌刺激因子增強Icam1 的分泌水平，從而促進其與龕的黏附［35］。但是，針對Icam1 的靶向治療研究進展并不順利，這源于其在正常的龕和腫瘤化的龕中扮演的不同角色［36］。Rela（p65）是NF-κB的結合因子，在研究中被證明與MSC 的增殖、分化關系密切［37］。在癌癥環境下，Rela 的激活可以促進MSC 的腫瘤化［38］。白血病的臨床治療中，伊馬替尼耐藥白血病細胞內的Rela 的表達水平明顯上調［39］。針對Rela的靶向治療可能為白血病提供一種新的治療方案［40］。此外，也有文獻報道在急性白血病中Rela 與TNF 存在高度相關性［41］。這與筆者在功能富集分析結果中出現TNF的相關條目相對應。

相關實驗文獻驗證了筆者篩選的潛在靶點與白血病的相關性以及在白血病治療中的潛在價值。針對疾病多靶點的調控研究是近年來中醫藥研究的主要方向之一，在多種癌癥的治療方面取得了進展［42-43］。同時，中藥在疾病中的雙向調節作用也被越來越多的研究證明［44］。中藥的雙向調節作用是否會在多靶點的調控中發揮獨特的作用，這種調節能否運用到白血病的治療中？這為今后的研究提出了方向。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學與蛋白組學相結合的方法，從理論和實驗驗證方面篩選出了BSJDTLF 的潛在靶點。還通過文獻挖掘，分析結果中的功能富集、通路富集和PPI 節點在白血病中的作用。這些研究為進一步揭示BSJDTLF 的作用機制提供了科學依據。在后續的研究中，筆者將利用白血病小鼠模型對篩選出的潛在結果進行驗證。

4 結論

本研究使用來自多個數據庫的BSJDTLF 相關靶標以及通過Cytoscape 構建了中藥復方化合物-靶點-疾病的關系網絡，篩選網絡中的關鍵節點，預測了補腎解毒通絡方阻止白血病復發的具體機制，為進一步的研究提供了科學基礎。