γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶高效表達(dá)及其催化合成γ-谷氨酰苯丙氨酸

劉栓英，劉會(huì)靈，龍夢飛，武文慧，張顯，徐美娟，楊套偉，饒志明

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫， 214122)

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT)在臨床診斷[1-2]、催化合成氨基酸衍生物[3]、藥物或藥物前體[4]以及改善苦味氨基酸的苦味等方面具有廣泛應(yīng)用[5]。研究表明氨基酸L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)在食物中可以呈現(xiàn)出苦味[6]，又是人體必需氨基酸[7]。SUZUKI等為改善其苦味，利用EscherichiacoliK-12來源的GGT 0.5 U/mL，以200 mmol/LL-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)為供體底物，200 mmol/LL-Phe為受體底物，最終γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-glutamylphenylalanine，γ-Glu-Phe)產(chǎn)率達(dá)到70%[6]。

Bacillussubtilis168(B.subtilis168)作為GGT表達(dá)的宿主細(xì)胞，存在分泌效率低、表達(dá)量不高的問題[8-9]。研究團(tuán)隊(duì)前期引入分子伴侶脂蛋白PrsA以及優(yōu)化Poly(A/T)尾巴的長度，酶活力達(dá)到30.4 U/mL[10]。轉(zhuǎn)錄水平的高低對(duì)于基因表達(dá)量具有重要影響[11]，啟動(dòng)子對(duì)于調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮著重要的作用[12]。通過對(duì)-10區(qū)上游的保守區(qū)域進(jìn)行非理性改造，可以提高目的蛋白表達(dá)量[13-14]。然而，目的基因在相同啟動(dòng)子的調(diào)控下，表達(dá)量也會(huì)受到起始翻譯速率的影響[15]。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)是影響起始翻譯速率的重要生物學(xué)元件。通過優(yōu)化編碼目的基因的RBS序列，可使目標(biāo)酶表達(dá)量提高10倍[16]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，RBS Calculator(https://www.denovodna.com/software/)可以計(jì)算得到具有不同起始翻譯速率的RBS序列[17-18]。

傳統(tǒng)方法獲得高表達(dá)量的GGT菌株耗時(shí)且困難。本研究建立了一種基于顯色反應(yīng)的高通量篩選方法，能快速且準(zhǔn)確篩選GGT高表達(dá)量菌株。通過對(duì)于啟動(dòng)子HpaII的-10區(qū)上游關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行兩輪迭代突變建立了啟動(dòng)子突變文庫，經(jīng)高通量篩選得到最優(yōu)啟動(dòng)子。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建人工RBS序列文庫，經(jīng)篩選得到最優(yōu)人工RBS序列，最大程度提高GGT表達(dá)量。另外，優(yōu)化了GGT催化L-Phe生成γ-Glu-Phe的轉(zhuǎn)化條件，提高了γ-Glu-Phe產(chǎn)率，從而為GGT應(yīng)用于食品行業(yè)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌B.subtilis168、pMA5-ggt-prsA/B.subtilis168、大腸桿菌EscherichiacoliJM109、質(zhì)粒pMA5由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 酶和試劑

BamH I、MluI、DpnI限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶,TaKaRa公司;高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司；卡那霉素、氨芐霉素、γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺一水合物、雙甘二肽、L-Phe、L-Gln,生工生物工程(上海)股份有限公司；γ-Glu-Phe標(biāo)樣、其他分析純試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白10.0，NaCl 10.0[19]。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白棟10.0，NaCl 10.0，瓊脂粉20。

SpI以及SpII培養(yǎng)基：

SpA(g/L)：K2HPO4·3H2O 28.0，KH2PO412.0，(NH4)2SO44.0，檸檬酸三鈉2.0。

SpB(g/L)：MgSO4·7H2O 0.4。

100×CAYE(g/L)：酵母粉100.0，水解酪蛋白20.0, MgCl2·6H2O 5.08，CaCl25.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母粉20.0，胰蛋白胨15.0，K2HPO4·3H2O 2.0，MgSO4·7H2O 1.0，pH 7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒提取和引物的設(shè)計(jì)

pMA5-ggt-prsA質(zhì)粒的提取按照質(zhì)粒提取試劑盒的方法進(jìn)行。在本文中涉及到的引物如表1所示。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 構(gòu)建啟動(dòng)子突變文庫

以提取的質(zhì)粒pMA5-ggt-prsA作為模板，以引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在DpnI的作用下37 ℃消化1 h，將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中，將重組細(xì)胞涂布在LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)上培養(yǎng)，菌落PCR篩選鑒定后，建立第一批啟動(dòng)子突變文庫。在第一輪得到的正向啟動(dòng)子菌株中提取質(zhì)粒，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，再以此質(zhì)粒作為模板，以引物F2以及R2進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在DpnI的作用下，37 ℃消化1 h，將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中，將重組細(xì)胞涂布在LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)上培養(yǎng)，菌落PCR篩選鑒定后，建立起第二批啟動(dòng)子突變文庫。

1.2.3 設(shè)計(jì)RBS序列文庫

在得到最優(yōu)啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，以相應(yīng)的質(zhì)粒作為模板，以引物F3、F4和R3進(jìn)行PCR，將人工RBS序列替換原始RBS，另外，以質(zhì)粒pMA5為模板，利用引物F5和R4進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物在DpnI 的作用下，37 ℃消化1 h。將消化產(chǎn)物、改造后的ggt基因經(jīng)核酸膠回收后，利用同源重組試劑盒進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入B.subtilis168感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)上培養(yǎng)，菌落PCR篩選鑒定后，建立起RBS文庫。

1.2.4 高通量篩選操作流程

首先挑取1.2.2、1.2.3中的突變體文庫中的陽性克隆子，在含有3 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔板中，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。離心獲得含有GGT的發(fā)酵上清液，在含有50 mmol/LL-Phe、50 mmol/LL-Gln 的3 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在反應(yīng)溫度為37 ℃，用0.1 mol/L Tri-HCl控制反應(yīng)pH為10.0，轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下，反應(yīng)10 min。取反應(yīng)液10 μL與100 μL 20 mmol/L鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)工作液充分混合，振蕩混勻20 min，然后先加入100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，再加入50 μL 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)充分混勻10 min，利用酶標(biāo)儀在600 nm處記錄吸光值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄豐度分析

取培養(yǎng)好的細(xì)胞發(fā)酵液2 mL置于離心管中，12 000 r/min的條件下離心5 min，棄去上清液，菌體可利用諾唯贊試劑盒進(jìn)行RNA提取。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同菌株GGT轉(zhuǎn)錄水平的具體步驟參考文獻(xiàn)所述[10]。

1.2.6 酶的表達(dá)與純化

取-40 ℃冰箱保存的菌種于固體LB平板劃線活化，挑取單菌落接入含有卡那霉素(50 μg/mL)抗性的10 mL LB培養(yǎng)液中。37 ℃過夜培養(yǎng)后按照6%的接種量轉(zhuǎn)接入含相同濃度抗生素50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心后獲得含有目的蛋白的發(fā)酵液上清液。

首先配制pH 10.0的飽和硫酸銨溶液，以0%～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%，80%～100%飽和度硫酸銨梯度分級(jí)沉淀。取體積分?jǐn)?shù)為40%的飽和硫酸銨沉淀的活性蛋白上清液，再以0%～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%，80%～100%飽和硫酸銨梯度沉淀，從而得到含有活性蛋白的沉淀，以Tri-HCl緩沖液(pH 8.0，0.1 mol/L)復(fù)溶，經(jīng)透析后以Hitrap DEAE FF柱層析分離，上樣緩沖液為Tri-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)，洗脫液為Tri-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)+0.5 mol/L NaCl，以0%～100%B，30 min梯度洗脫，收集洗脫峰[20]。將得到的純酶通過SDS-PAGE方法進(jìn)行分析，以及采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.7 酶活力的測定

取培養(yǎng)48 h的菌液50 mL，于4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min收集含有活性目的蛋白的上清液。酶活力測定方法如下：1 mL的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中包含100 mmol/L Tris-HCl(pH 10.0)，2.5 mmol/L γ-L-谷氨酰-對(duì)硝基苯胺一水合物，60 mmol/L雙甘二肽和5 μL適當(dāng)稀釋的酶液。37 ℃反應(yīng)15 min，加入200 μL 3.5 mol/L的醋酸終止反應(yīng)，以不添加雙甘二肽，添加等體積的水的反應(yīng)體系作為對(duì)照，利用酶標(biāo)儀在410 nm處測定吸光度值。通過實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度差值計(jì)算轉(zhuǎn)肽酶活力。酶活力定義為：1 min 生成1 μmol的對(duì)硝基苯胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.8 γ-Glu-Phe的檢測

以GGT作為催化劑，以L-Gln、L-Phe為底物，在適宜催化反應(yīng)條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，定時(shí)取樣，每次取樣過程中加入等體積的10%三氟乙酸終止轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。得到的反應(yīng)產(chǎn)物，通過0.22 μm過濾膜過濾。利用高效液相色譜儀1200 Infinity系列進(jìn)行檢測，檢測條件為：紫外檢測器，X BridgetM C18柱(Agilent 5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相A為50 mmol/L乙酸鈉(含1%的N,N-二甲基甲酰胺)，流動(dòng)相B為50%乙腈，流速1 mL/min，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量篩選方法建立

表2 OPA與反應(yīng)體系中化合物之間的顯色反應(yīng)Table 2 Chromogenic reactions between OPA and compounds present in the reaction system

圖1 釋放的濃度和A600nm的關(guān)系Fig.1 The relationship between the concentration of released

2.2 通過優(yōu)化啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域提高GGT表達(dá)量

HpaII是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，其-10區(qū)上游7個(gè)堿基是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)鍵區(qū)域。通過對(duì)關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行非理性改造，提高基因的轉(zhuǎn)錄水平以及表達(dá)量。在得到的目的蛋白表達(dá)量提高的正向啟動(dòng)子突變中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、SDS-PAGE與酶活力檢測等方式分析了基因的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)以及酶活力情況。結(jié)果如圖2、圖3所示，較原始啟動(dòng)子HpaII相比，突變體EA13HpaII、EB6HpaII、ED11HpaII、EF3HpaII、EG2HpaII(基因序列見表3)啟動(dòng)子調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，其中EF3HpaII的轉(zhuǎn)錄豐度較原始啟動(dòng)子HpaII提高了5倍。但是，檢測pMA5-EF3HpaII-ggt-prsA/B.subtilis168酶活力較pMA5-HpaII-ggt-prsA/B.subtilis168(WT)僅提高了63%。這也就表明GGT的表達(dá)量不僅僅和基因的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。

圖2 不同啟動(dòng)子菌株中GGT的表達(dá)量以及轉(zhuǎn)錄豐度Fig.2 Transcription level and GGT production of recombinant strains with different promoters注：GGT 以HpaII(WT)、EA13HpaII、 EB6HpaII、ED11HpaII、EF3HpaII及EG2HpaII為啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)

M-Marker；1-陰性對(duì)照,B.subtilis 168/pMA5；2～7-GGT在B.subtilis 168中以 HpaII、ED11HpaII、EB6HpaII、EG2HpaII、EA13HpaII及EF3HpaII為啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)圖3 SDS-PAGE分析不同啟動(dòng)子重組菌株中GGT的表達(dá)量Fig.3 SDS-PAGE analysis of GGT production in recombinant strains with different promoters.

表3 不同啟動(dòng)子-10區(qū)上游的7個(gè)堿基序列Table 3 The 7 bases upstream of the -10 region in different promoters

2.3 RBS序列對(duì)于ggt表達(dá)的影響

為了探究2.2中g(shù)gt基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)提高程度存在重大差異的原因，首先，我們用DNAMAN軟件分析了基因起始密碼子前40 bp左右的EF3HpaIIRBS序列，在EF3HpaIIRBS的SD序列中，存在著多個(gè)明顯的頸環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，這嚴(yán)重影響基因的起始翻譯速率，更有甚者導(dǎo)致基因無法表達(dá)[21-22]。

另外，通過RBS Calculator分析EA13HpaII、EB6HpaII、ED11HpaII、EF3HpaII、EG2HpaII以及HpaII起始翻譯速率(表4)，HpaII的起始翻譯速率明顯低于EF3HpaII等其他正向啟動(dòng)子。通過以上結(jié)果，表明基因的起始翻譯速率可能就是造成基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)提高程度不一致的原因。因此，找到與正向啟動(dòng)子更加適配的RBS序列是進(jìn)一步提高目的基因表達(dá)量的關(guān)鍵。

表4 不同RBS序列的起始翻譯速率Table 4 The initial translation speeds of different RBS sequences

2.4 優(yōu)化ggt起始翻譯速率提高表達(dá)量

為了進(jìn)一步提高GGT的表達(dá)量，我們利用RBS Calculator設(shè)計(jì)與啟動(dòng)子正向突變菌株pMA5-EF3HpaII-ggt-prsA/B.subtilis168更加適配的RBS序列，從而得到具有梯度起始翻譯速率(1 000～4 986 270.7 au)的500個(gè)RBS序列文庫。按照其起始翻譯速率不同，將其共分為10組，1×103～2×103、2×103～5×103、5×103～1×104、1×104～5×104、5×104～1×105、1×105～2×105、2×105～5×105、5×105～1×106、1×106～2×106、2×106～4 986 270.7 au，每組50個(gè)RBS。

最終，我們得到362個(gè)較EF3HpaII原始RBS酶活力提高的人工RBS序列。根據(jù)不同RBS序列調(diào)控表達(dá)的GGT的轉(zhuǎn)肽酶活力差異，從低到高排列為RBS1～RBS362，其中RBS361、RBS362起始翻譯速率為2 986 410.3和3 974 351.5 au。結(jié)果如圖4所示，重組菌株RBS361和RBS362經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)后，轉(zhuǎn)肽酶活力為56.95和60.25 U/mL，是菌株pMA5-HpaII-ggt-prsA/B.subtilis168(WT)的1.91和2.02倍。基于此，我們又利用生物分析軟件DNAMAN分析了RBS361和RBS362的SD序列，結(jié)果如圖5所示，經(jīng)優(yōu)化后的人工RBS361和RBS362的頸環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)得到明顯改善。以上研究結(jié)果表明，在菌株pMA5-EF3HpaII-ggt-prsA/B.subtilis168中，人工RBS序列比原始RBS序列更適配，從而能更大程度上提高GGT的表達(dá)量。

圖4 不同RBS序列重組菌株GGT的表達(dá)量Fig.4 GGT production of recombinant strains with different RBS sequencesGGT在HpaII(WT)、EF3HpaII、EF3HpaIIRBS361及EF3HpaIIRBS362調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)

a-EF3HpaII RBS；b-EF3HpaII RBS361；c-EF3HpaII RBS362圖5 不同RBS中SD序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 The secondary structure of SD sequences in different RBS

2.5 GGT催化L-Phe合成γ-Glu-Phe的條件優(yōu)化

在前期的研究中，我們已經(jīng)對(duì)于GGT的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探索[10]。本研究在GGT催化合成γ-Glu-Phe的催化反應(yīng)過程中，優(yōu)化了反應(yīng)體系中底物濃度配比、反應(yīng)溫度、初始反應(yīng)pH以及酶量等催化條件，提高了γ-Glu-Phe產(chǎn)率。

2.5.1 底物濃度對(duì)GGT催化合成γ-Glu-Phe的影響

由于提高受體濃度有利于降低GGT水解副反應(yīng)，優(yōu)化底物濃度配比可以提高γ-Glu-Phe產(chǎn)率。控制反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)體系pH 10.0，其他催化條件不變，控制供體底物50 mmol/LL-Gln與受體底物L(fēng)-Phe濃度配比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化。其結(jié)果如圖6-a所示，當(dāng)供體底物50 mmol/LL-Gln與受體底物L(fēng)-Phe濃度配比為1∶4時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最高，產(chǎn)量為10.62 g/L，產(chǎn)率達(dá)到70%。

2.5.2 溫度對(duì)GGT催化合成γ-Glu-Phe的影響

溫度可以影響酶促反應(yīng)速率，從而影響酶催化合成γ-Glu-Phe。控制供體底物50 mmol/LL-Gln與受體底物L(fēng)-Phe濃度配比為1∶4，反應(yīng)體系pH 10.0，其他催化條件一致的情況下，分別在25、30、35、40、45 ℃ 下進(jìn)行酶催化反應(yīng)合成γ-Glu-Phe產(chǎn)物。結(jié)果如圖6-b所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量最高，達(dá)到11.98 g/L，產(chǎn)率達(dá)到79%。

2.5.3 初始pH對(duì)GGT催化合成γ-Glu-Phe的影響

控制供體底物50 mmol/LL-Gln與受體底物L(fēng)-Phe 濃度配比為1∶4，反應(yīng)溫度為35 ℃，其他催化條件一致的情況下，設(shè)置轉(zhuǎn)化體系初始pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)合成γ-Glu-Phe產(chǎn)物。結(jié)果如圖6-c所示，在初始反應(yīng)pH<10.0時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率隨pH的升高而升高。當(dāng)pH為10.0左右時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最高，產(chǎn)量為12.14 g/L，產(chǎn)率為80%，在初始反應(yīng)pH>10.0時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量大幅度下降。這是由于GGT最適轉(zhuǎn)肽酶活力pH=10.0，當(dāng)pH>10.0時(shí)，GGT轉(zhuǎn)肽活性降低[10]，從而其催化合成產(chǎn)物γ-glu-Phe的能力下降，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率下降。

2.5.4 酶濃度對(duì)于GGT催化合成γ-Glu-Phe的影響

實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用中，為了最大程度提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本，將催化反應(yīng)體系中酶濃度控制在適宜的水平也是至關(guān)重要的。控制其他催化條件相同，采用供體底物50 mmol/LL-Gln與受體底物200 mmol/LL-Phe，將反應(yīng)溫度設(shè)為35 ℃，反應(yīng)初始pH 10.0，酶濃度分別為0.2、0.6、1、1.4、1.8 U/mL 條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)合成γ-Glu-Phe產(chǎn)物。結(jié)果如圖6-d所示，當(dāng)反應(yīng)體系中酶濃度<1 U/mL時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率以及產(chǎn)物產(chǎn)率隨酶濃度增加而逐漸升高，當(dāng)酶量在1 U/mL左右時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最高，產(chǎn)量為14.35 g/L，產(chǎn)率達(dá)到94%。當(dāng)GGT濃度過高時(shí)，會(huì)發(fā)生自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，從而生成谷氨酸等副產(chǎn)物[3]。所以，當(dāng)酶量>1 U/mL時(shí)，γ-Glu-Phe產(chǎn)物產(chǎn)率大幅度下降。

3 結(jié)論與討論